【正文】 Construction of Bluray Induced Expression System in sf9 insect Cells 學(xué)生姓名 : 蔡澤蘄 學(xué)生學(xué)號(hào) : 20xx30420xx07 學(xué)生專業(yè) : 生物學(xué)基地班 指導(dǎo)教師 : 徐富強(qiáng) 教 授 指導(dǎo)小組 : 吳 陽 博后 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 二 〇 一 五 年六 月 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 目錄 摘 要 ..................................................................................................................................... I Abstract .............................................................................................................................. III 縮略詞表 ............................................................................................................................ IV 1 前言 ................................................................................................................................... 1 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 ........................................................................................................ 1 ..................................................................................... 1 ..................................................................................... 1 光誘導(dǎo)啟動(dòng)子 ............................................................................................. 2 VPEL222轉(zhuǎn)錄激活系 統(tǒng) ..................................................................................... 3 VPEL222系統(tǒng)在 293T細(xì)胞中的表現(xiàn) ............................................................... 4 pMIB/V5His載體 ................................................................................................ 5 .................................................................................................... 5 ....................................................................................................................... 6 實(shí)驗(yàn)材料 ................................................................................................................ 6 材料與試劑 ................................................................................................. 6 ................................................................................. 6 ................................................................................................................ 7 sf9細(xì)胞的傳代培養(yǎng) ................................................................................... 7 分子克隆基本策略 ..................................................................................... 7 通用 PCR體系及程序 ............................................................................... 8 酶切體系和方法及膠回收試劑盒的使用 ................................................. 8 ......................................................................................... 9 轉(zhuǎn)化用 DH5α 感受態(tài)的制備 ........................................................ 9 轉(zhuǎn)化的步驟 ................................................................................................. 9 質(zhì)粒抽提試劑盒的使用 ........................................................................... 10 DNA的非柱回收簡單純化步驟 .................................................... 10 ...................................................................................................... 10 ...................................................................................................................... 11 3結(jié)果與分析 ..................................................................................................................... 12 .......................................................................................................... 12 .............................................................................................................. 12 .............................................................................................................. 13 參考文獻(xiàn) ............................................................................................................................ 15 致謝 .................................................................................................................................... 17 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 I 摘 要 光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)作為人工誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中最璀璨的一員，正受到越來越重要的關(guān)注。盡管如此，當(dāng)前主要的光控表達(dá)系統(tǒng)仍有很多弱點(diǎn)限制著它的應(yīng)用，比如：蛋白本身的毒性、狹窄的調(diào)控范圍以及反應(yīng)緩慢的激活和去激活作用，相比傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) 沒有壓倒性優(yōu)勢(shì)。 通過這個(gè)系統(tǒng)，我們?cè)诙喾N哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)試了光控轉(zhuǎn)錄作用。 本文將講述這個(gè)新的光控表達(dá)系統(tǒng)在 sf9昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。 Sf9細(xì)胞是由 . Smith 和 . Cherry 在 1983年從細(xì)胞株 IPLBSF 21 AE得來的一個(gè)克隆。 sf9細(xì)胞屬于半貼壁型細(xì)胞系，可以進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，也可以進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，在應(yīng)用于蛋白的表達(dá)與制備純化中，有著許多的優(yōu)點(diǎn)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng) (baculovirus expression system)是近年來應(yīng)用較多的真核表達(dá)系統(tǒng)，它可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)多種外源基因，包括真菌，植物，細(xì)菌，病毒的基因。目前研究較多的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒 (AcMNPV)。該桿狀病毒是黃杉毒蛾核多角體病毒（ OpMNPV），它的天然宿主是道格拉斯冷杉毒蛾。桿狀病毒早期啟動(dòng)子可以在沒有病毒因素的情況下利用細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。如： 1）表達(dá)的重組蛋白能正確折疊 ，并形成二硫鍵； 2） 翻譯后可進(jìn)行修飾加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信號(hào)肽切割等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白； 3） 與其他基于 sf9昆蟲細(xì)胞的藍(lán)光誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 II 真核表達(dá)系統(tǒng)相比， 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以高效表達(dá)外源基因，表達(dá)量最高可達(dá)被感染 昆蟲細(xì)胞總蛋白量的 5 0 ％； 4）可以容納大片段外源基因。我們的主要工作是構(gòu)建承載該系統(tǒng)的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞，獲得報(bào)告基因的表達(dá)情況。 而本文就主要講述對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的探索與測(cè)試所做的努力。此次在昆蟲細(xì)胞中對(duì)該系統(tǒng)的實(shí)踐則是首次。 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 20xx屆本科畢業(yè)論文 III Abstract As the most bright one of the artificial induced expression system, optogeic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor to control gene expression has the inparable advantages