【正文】 胞儀分析熒光信號，從而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細(xì)胞（即特異基因表達(dá)的細(xì)胞）作出判斷。216。216。216。（三）免疫組化實(shí)驗(yàn)可對組織 /細(xì)胞 表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位檢測目 錄216。 酶聯(lián)免疫吸附分析目 錄 免疫組織化學(xué)（ immunohistochemistry） 與 免疫細(xì)胞化學(xué)（ immunocytochemistry）原理相同，都是利用標(biāo)記的特異性抗體通過抗原 抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原位檢測特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡稱為免疫組化實(shí)驗(yàn)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析與 Western 印跡原理相似但形式不同目 錄特點(diǎn)：具有特異性；靈敏度很高；穩(wěn)定、操作簡便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查，尤其適用于檢測體液中微量的特異性抗體或抗原；既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析。 該方法不需經(jīng)電泳分離待檢樣品蛋白質(zhì)，而是預(yù)先將樣品包被在支持體上，以后反應(yīng)過程與 Western 印跡大致相同 ——順序結(jié)合（即 “吸附 ”）特異抗體（一抗）及與酶連接的第二抗體（也可預(yù)先包被抗體， “吸附 ”抗原），再進(jìn)行酶 底物反應(yīng)。當(dāng)在蛋白質(zhì)水平上檢測特定基因的表達(dá)活性時(shí)，最常用的方法就是利用 Western 印跡對細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。2．實(shí)時(shí)定量 PCR目 錄目前有 5種技術(shù)用于實(shí)時(shí)定量 PCR： 其中最經(jīng)濟(jì)、簡便的技術(shù)是利用熒光染料（如 SYBR Green ）與雙鏈 DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性，指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加； 其他 4種方法都是以熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸為探針與正確的擴(kuò)增子雜交，包括 5’核酸酶法（即人們熟知的TaqManTM）、分子信標(biāo)、 ScropionsTM和探針雜交法，它們擁有更強(qiáng)的特異性，可以避免對 PCR后溶解曲線的需求，以及后續(xù)的 Southern雜交或?qū)U(kuò)增子的測序鑒定，但是成本較高。常用于 mRNA的定量分析 216。 該方法適合對待測樣品進(jìn)行初步篩選，目前已廣泛被實(shí)時(shí)定量 PCR替代。 RTPCR技術(shù)一般用于 RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測 RNA樣品進(jìn)行半定量分析。 反轉(zhuǎn)錄 PCR（ reverse transcriptionPCR， RTPCR） 是一種簡單、快捷地對 RNA進(jìn)行定性、定量分析的方法。3．原位雜交（ in situ hybridization， ISH）目 錄（二）兩種變換的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是常用的mRNA檢測方法1．反轉(zhuǎn)錄 PCR216。216。216。是利用雜交原理建立的組織原位 mRNA檢測技術(shù)，可對細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的 mRNA進(jìn)行區(qū)域定位。 目 錄核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖目 錄216?？捎糜?mRNA定量和 RNA剪接分析 216。 既可分析 mRNA表達(dá)又可驗(yàn)證 cDNA新序列 216。這里主要針對已知基因的常用表達(dá)分析方法做一介紹。目 錄第二十六章 基因表達(dá)及功能分析的基本策略STRATEGIES FOR ANALYZING GENE EXPRESSION AND FUNCTION目 錄第一節(jié) 基因表達(dá)的分析策略Strategies for Analyzing Gene Expression目 錄一、通過檢測 mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達(dá)分析分為 :封閉性系統(tǒng)研究方法 :例如 DNA微陣列、 Northern印跡、實(shí)時(shí) RTPCR等方法，其應(yīng)用范圍僅限于已測序的物種，只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法 : 如差異顯示 PCR、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物 PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。目 錄（一）基于雜交原理的方法可檢測 mRNA表達(dá)水平1． Northern印跡 （ Northern blot）216。 是一種基于 RNADNA雜交原理建立的一種 RNA分析技術(shù)目 錄Northern印跡分析原理示意圖目 錄2．核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ ribonuclease protection assay， RPA）216。是一種基于雜交原理分析 mRNA的方法，既可對mRNA進(jìn)行定量分析又可研究其結(jié)構(gòu)特征，靈敏度和特異性都很高?？蓪?mRNA進(jìn)行區(qū)域定位 216。同時(shí)也可作為定量分析的補(bǔ)充。通過設(shè)計(jì)與目標(biāo) mRNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列，標(biāo)記后作為探針；該探針能夠特異性地與目標(biāo)靶序列雜交，檢測標(biāo)記信號來確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息。雖然原位雜交在功能性方面提供的信息較少，但是該技術(shù)還是被廣泛用于組織中的基因表達(dá)分析，這是因?yàn)槠漭^高的穩(wěn)定性、較廣泛的靶點(diǎn)和組織適用性。 可用于 mRNA的半定量分析 216。它是以 mRNA為模板，體外擴(kuò)增 cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的 PCR擴(kuò)增。216。目 錄216。實(shí)時(shí)定量 PCR (Realtime Quantitative Polymerase chain Reaction,RQPCR)是定量分析 mRNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對 PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。目 錄SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR分析原理示意圖 目 錄二、通過蛋白質(zhì)檢測揭示基因 翻譯水平的表達(dá)特征 Western 印跡（ Western blot） 是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì) /多肽分子。（一）采用特異抗體經(jīng) Western 印跡可直接 測定基因編碼多肽目 錄1. 蛋白質(zhì)樣品的制備2. SDSPAGE分離3. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜4. 特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交5. 再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測標(biāo)記信號的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的 Ig）6. 最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Western blot 基本程序目 錄 酶聯(lián)免疫吸附分析（ Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA） 也是一種建立在抗原 抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)分析基本方法。反應(yīng)后通過專門的酶標(biāo)儀測定、記錄數(shù)據(jù)。 被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和免疫學(xué)等領(lǐng)域。近年來由于熒光標(biāo)記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為 免疫熒光法。（ immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（ confocal microscopy） 對靶分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平分析基因表達(dá)的直觀方法。其中抗體對于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。運(yùn)用雙重著色或多重著色程序同時(shí)對多個(gè)感興趣的靶分子進(jìn)行檢測，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計(jì)量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析 表達(dá)特異蛋白質(zhì)的陽性細(xì)胞目 錄216。216。216。目 錄三、高通量檢測技術(shù)成為基因表達(dá)研究的有力工具 高通量篩選 (High throughput screening， HTS)技術(shù)是在大量核酸、多肽信息累計(jì)（即資料庫）基礎(chǔ)上，采用微板作為分子載體，制作集成 “芯片 ”，以自動化操作系統(tǒng)進(jìn)行分子雜交的試驗(yàn)過程。 高通量檢測技術(shù)適合 “組學(xué) ”（ omics）研究，更適合生命活動過程相關(guān)的基因表達(dá)譜分析。 其中 基因表達(dá)譜（ expression prifile）分析 是目前基因芯片應(yīng)