【正文】 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。 （ 1） Southern雜交（ Southern印跡）： 用適當(dāng)?shù)南拗泼赶郎y(cè) DNA，電泳后，將凝膠浸于堿性溶液中以變性 DNA，再經(jīng)毛細(xì)作用將變性的DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移至雜交膜上并固定，然后與放射性同位素標(biāo)記的核酸探針雜交，再經(jīng)放射自顯影顯示雜交結(jié)果。核酸探針： 指序列或功能特性已知的標(biāo)記分子，為雙鏈或單鏈，長(zhǎng)度通常為幾十至幾百 bp,包括 DNA探針、 RNA探針和 cDNA探針。標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。然后與核酸探針進(jìn)行雜交。 核酸分子的放射性同位素標(biāo)記應(yīng)用舉例 利用切口平移技術(shù)制備 DNA放射性探針 分子雜交類型 根據(jù)鑒定對(duì)象不同，可將分子雜交法分為 3種類型：Southern雜交由 1975年創(chuàng)立。216。 放射性強(qiáng)度的探測(cè)（ 1）蓋革計(jì)數(shù)器（ Geiger counter tuber），閃爍計(jì)數(shù)器。 放射性的衰變類型α 射線：帶正電荷的高速粒子流β 射線：帶負(fù)電荷的 粒子流γ 射線：光子流216。在分子生物學(xué)研究中，得到應(yīng)用的是放射性同位素。 放射性同位素 同位素可分為穩(wěn)定同位素和不穩(wěn)定同位素，后者又稱為放射性同位素。 (2)電導(dǎo)轉(zhuǎn)基因法 (3)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法 (4)胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法 (5)精子載體法 植物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)Ti質(zhì)粒介導(dǎo) (2)電轉(zhuǎn)化法 (3)基因槍法 放射性同位素技術(shù)同位素： 原子序數(shù)相同而質(zhì)量不同的元素。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨 DNA片段的范圍為 50kb之間216。 1 DNA操作技術(shù) 類 功 1962年 Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967年 Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶。到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物。再將目的基因克隆重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。分子。分子。片段。216。1970年 Mandel和 Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收 λ噬菌體 DNA。認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。復(fù)制機(jī)制。題。白質(zhì)。解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。 第五章 分子生物學(xué)研究方法（上） 本章主要內(nèi)容l 常見的 DNA操作技術(shù)l 基因克隆技術(shù)簡(jiǎn)介l 蛋白質(zhì)組學(xué)及研究技術(shù)引言216。重組重組 DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件技術(shù)發(fā)展史上的重大事件(1) 40年代，年代， 解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題。 確定了確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是 DNA而不是蛋而不是蛋白質(zhì)。(2)50年代，年代， 解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題。 建立了建立了 DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出了半保留復(fù)制機(jī)制。(3)50年代末至年代末至 60年代，相繼提出了年代，相繼提出了 ““ 中心法則中心法則 ””和操縱子學(xué)說和操縱子學(xué)說 , 成功地破譯了遺傳密碼，充分成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)途徑。從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體。1972年， Cohen等人又報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞同樣能夠攝取質(zhì)粒 DNA。 基因工程的主要內(nèi)容或步驟基因工程的主要內(nèi)容或步驟 “ 分分 切切 連連 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 篩篩 ””（（ 1）從基因組中）從基因組中 分離分離 、或、或 PCR擴(kuò)增、或人工合成帶有目的擴(kuò)增、或人工合成帶有目的基因的基因的 DNA片段。（（ 2）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e）用適當(dāng)?shù)南拗泼阜謩e 切割切割 適當(dāng)?shù)倪m當(dāng)?shù)?載體分子和載體分子和 含有目的含有目的基因的基因的 DNA分子。（（ 3）將目的基因）將目的基因 連接連接 到載體分子上，形成重組到載體分子上，形成重組 DNA分子。（（ 4）將重組）將重組 DNA分子分子 轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中并增殖。（（ 5）） 篩選篩選 重組轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增目的基因。再將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使表達(dá)目的產(chǎn)物?；蚬こ碳夹g(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的 根本特征 ：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力。重組 DNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶 酶 能限制性核酸內(nèi)切 酶 識(shí)別 并在特定位點(diǎn)切開 DNADNA連 接 酶 通 過 磷酸二 酯鍵 把兩個(gè)或多個(gè) DNA片段 連 接成一個(gè) DNA分子DNA聚合 酶 I（大 腸 桿菌） 按 5ˊ 到 3ˊ 方向加入新的核苷酸， 補(bǔ) 平 DNA雙 鏈 中的缺口反 轉(zhuǎn)錄 酶 按照 RNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互 補(bǔ) 原 則 合成 DNA鏈多核苷酸激 酶 把磷酸基 團(tuán) 加到多聚核苷酸 鏈 的 5ˊOH 末端（ 進(jìn) 行末端 標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 或用來 進(jìn) 行 DNA的 連 接末端 轉(zhuǎn) 移 酶 在雙 鏈 核酸的 3ˊ 末端加上多聚 單 核苷酸DNA外切 酶 III 從 DNA鏈 的 3ˊ 末端逐個(gè)切除 單 核苷酸λ 噬菌體 DNA外切 酶 從 DNA鏈 的 5ˊ 末端逐個(gè)切除 單 核苷酸堿性磷酸 酯 酶 切除位于 DNA鏈 5ˊ 或 3ˊ 末端的磷酸基 團(tuán) 科學(xué)家已幾乎能隨心所欲地把任何 DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術(shù)將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。 ? DNA分子的切割與連接? 核酸分子雜交? 凝膠電泳? 細(xì)胞轉(zhuǎn)化? 核酸序列分析? 基因的人工合成? 基因的定點(diǎn)突變? PCR擴(kuò)增? 基因敲除 核酸的凝膠電泳原理：種類： 瓊脂糖 （ agarose） 凝膠電泳； 聚丙烯酰胺 （ polyacrylamide） 凝膠電泳用途： 鑒定重組 DNA分子 蛋白質(zhì)與核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作圖216。 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠 分辨范圍為 11000個(gè)堿基對(duì)凝膠類型及濃度 分離 DNA片段的大小范圍（ bp） % 瓊脂糖 50 000~1 000 % 瓊脂糖 20 000~1 000 % 瓊脂糖 6 000~300 % 聚丙烯酰胺 1 000~100 % 聚丙烯酰胺 500~25 % 聚丙烯酰胺 50~1 凝膠的分辨能力同凝膠類型和濃度有關(guān)，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。 轉(zhuǎn)基因方法 細(xì)菌轉(zhuǎn)基因的方法 (1)結(jié)合（ conjugation） (2)轉(zhuǎn)化（ transformation） (常規(guī)轉(zhuǎn)化、電轉(zhuǎn)化等 ) (3)轉(zhuǎn)染（ transfection） (4)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法 (1)顯微注射法：包括細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。216。不穩(wěn)定同位素原子核結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易自發(fā)產(chǎn)生衰變，產(chǎn)生 α射線、 β 射線和 γ 射線等，同時(shí)從不穩(wěn)定同位素變成穩(wěn)定同位素。 核酸的分子雜交216。 分子生物學(xué)研究中常用的放射性同位素及其性質(zhì)元素名稱 半衰期 5700年 147N + 10n → 146C + 11H146C → 147N + 01e 23892U → 20682Pb + 842He + 601e (t1/2 = 10 9a)216。（ 2）放射自顯影： X光乳膠片覆蓋于樣品，在黑暗中， 70℃ ，曝光。 放射性分子的制備 ：核物理，化學(xué)，生化反應(yīng)，生化分離技術(shù)216。Southern雜交： 將將 DNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進(jìn)行雜交。Northern雜交 ：： 將將 RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移至雜交濾膜上，然后與核酸探針進(jìn)行雜交。Western雜交 ：： 將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，然后同