【正文】 載體在體外連接 —— 將人工構(gòu)建的重組 DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增 —— 選擇與鑒定重組的克隆。如糖基化、氨基化和磷酸化等。 重組體（重組子）：攜帶重組 DNA分子的受體細(xì)胞。 ? 噬菌體載體； ? 病毒載體； 受體：用于擴(kuò)增載體及目的基因 的細(xì)胞。 ? PSF2124— 帶有氨芐青霉素抗菌素基因（ Ampr）； ? PMB8— 帶有 COELⅠ （ 大腸桿菌素因子 ） 松馳型復(fù)制子； ? PSC101— 帶有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（ Tetr）。 PBR322質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒載體，有萬能質(zhì)粒載體之稱。 ? （ 3）、類型：根據(jù) DNA分子中是否含有接合轉(zhuǎn)移基因 分為接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒； ? 根據(jù)拷貝數(shù)多少可分為低拷貝“也稱為嚴(yán)緊型”和高拷貝“也稱為松馳型”質(zhì)粒。改造的內(nèi)容有（ 1）、質(zhì)粒改小，以增加有效的裝載量和拷貝數(shù)； ? 質(zhì)粒載體（ Plasmid Uector）： ? 問題：什么是質(zhì)粒載體？有何生物特征？做為理想的質(zhì)粒載體是哪一類？ ? （ 1）、質(zhì)粒載體是染色體外能自我復(fù)制的雙鏈閉合雜環(huán)狀 DNA分子。 ? 分類 （ P13）： ? 做為載體必須符合哪些條件： ? ? 在細(xì)胞中能自我復(fù)制，即本身是復(fù)制子 — 可繁殖性； ? 具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片斷后，不影響其本身的復(fù)制功能 —— 可利用性； ? ? 在基因重組中有 1— 2個(gè)篩選標(biāo)記從而容易進(jìn)行選擇 — 具有便利性； ? ? 分子小，多拷貝，安全性好，適應(yīng)性強(qiáng)，容易控制，便于表達(dá)待。 ? 但用量大。 T4DNA連接酶是 T4噬菌體編碼的一種重要連接酶 ? 機(jī)理 ? 特點(diǎn)： DNA連接酶只能封 T4DNA連接酶閉缺口，而不能封閉裂口；只能連接粘性末端，不能連接平整末端。 ? 終止限制酶反應(yīng)的方法：加熱失活， 65℃ 保溫 5分鐘；如是耐熱酶，則可用脲、 SOS、及胍等變性劑使之失活。 ? 第二型限制酶的特點(diǎn)： ? （ 1）、具有很強(qiáng)的底物專一性，其底物只能是雙鏈DNA分子，對單鏈 RNA及雙鏈 DNARNA雜交分子均不起作用； ? （ 2）、具有很強(qiáng)的位點(diǎn)專一性，它的識別位點(diǎn)為 47核苷酸序列，甲基化位點(diǎn)就是識別位點(diǎn)，識別位點(diǎn)也切割部位； ? （ 3）、位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重螺旋結(jié)構(gòu)。 ? 第三型限制酶由兩種亞基組成，具有雙重功能，輔因子為 ATP、 Mg2+，也受 S腺苷蛋氨酸激活，但不是必需。 ? 第二型 限制酶由兩個(gè)相同的亞基組成，分子量在 210萬道爾頓之間，僅具有限作用，輔助因子僅為 Mg2+，識別位點(diǎn)具有旋轉(zhuǎn)對稱性，切割位點(diǎn)與識別一致，其底物為雙螺旋 DNA。而Haemophilus parahaemolyticus 的二種酶為： HphⅠ 、HphⅡ 。 ? Haemophilus influenzae Rf的三種酶為： HinfⅠ 、HinfⅡ 、 HinfⅢ 。 ? 如：來自 Haemophilus aeygtius(埃及嗜血桿菌 )的三種酶為： HaeⅠ 、 HaeⅡ 、 HaeⅢ 。 ? 限制酶：凡能識別和切割雙螺旋 DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶類，全稱是限制性核酸內(nèi)切酶或限制性內(nèi)切酶核酸。 一、基因工程的基本工具 ? 基因工程的基本工具：工具酶、基因運(yùn)載體和受體細(xì)胞。更為重要的是可以運(yùn)用基基因工程技術(shù)方法去了解基因的功能以及基因調(diào)控的機(jī)理等一系列理論問題。 ? （ 2）、一方面是科學(xué)發(fā)展的必然要求（當(dāng)時(shí)育種工作、癌等的治療都要求科技應(yīng)有所突破）； ? 另一方面是有關(guān)基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)理論研究的重大突破和技術(shù)的必然結(jié)果。三者之間有關(guān)系。 什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的理論及意義是什么？ ? （ 1）、 基因工程：應(yīng)用 DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物的遺傳性，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)的技術(shù)。 ? （ 3）、所以基因表達(dá)不能說就是遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯從（ DNA）傳蛋白質(zhì)的過程。 ? （ 2）、根據(jù)是否轉(zhuǎn)錄和翻譯功能可分三類： ? 一類是既有轉(zhuǎn)錄功能又有翻譯功能的基因，這類基因是指編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因及編碼阻 蛋白的調(diào)節(jié)基因（統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)基因）；這也是人類基因組計(jì)劃中所的功能基因（ 26383— 39114個(gè)）。第二章 基因工程 ? 一、緒論 ? 什么是基因？如何分類？什么是基因表達(dá)？ ? 什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的理論及意義是什么？ 什么是基因？如何分類？ 什么是基因表達(dá)？ ? （ 1）、 不少教科書給基因下的定義是：基因是脫氧核糖核酸（ DNA）分子上的一個(gè)特定的片段。 ? 基因：是一個(gè)含有特定遺傳信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性狀的功能和結(jié)構(gòu)單位。 ? 第二類是只有轉(zhuǎn)錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括編碼 tRNA和 rRNA的基因； ? 第三類是既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯的基因，包括啟動基因、操縱基因、增強(qiáng)子等（有時(shí)也把它稱為調(diào)控基因）。 ? 基因表達(dá)：是基因表現(xiàn)其生物功能所經(jīng)歷的一系列分子轉(zhuǎn)化和相互作用的過程。 ? 遺傳工程：是包括基因工程在內(nèi)的人工改造生物遺傳性的全部技術(shù)； ? DNA重組技術(shù)：是采用酶法，將不同來源 DNA進(jìn)行體外切割與連接構(gòu)成雜種 DNA分子： ? 分子克?。褐饕侵?DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程。但是有不同。 ? （ 3）、意義 ：基因重組技術(shù)使人類可以打破物種之間遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移交換的天然屏障；跨越生物遠(yuǎn)緣不能雜交的鴻溝，使人類有計(jì)劃、有目的地進(jìn)行在物種間甚至在動物、植物、微生物之間的基因雜交，達(dá)到有選擇和定向性改變生物的基本性狀，或融合進(jìn)人們所需的優(yōu)良性狀，從而獲得新的生物制品或制造出新的物種。另外在人類基因圖譜繪制完成后，將有可能為人類征服各種疾病開辟新的途徑。 ? （一）、工具酶：基因工程中所使用的酶類。 ? （ 1）、限制酶的命名：是根屬名和種名相結(jié)合的原則。 ? Haemophilus influenzae Rd(流感嗜血桿菌 )的三種酶為： HindⅠ 、 HindⅡ 、 HindⅢ 。 ? 當(dāng)同屬不同種的兩種菌名前兩個(gè)字母完全相同時(shí)，則其中一種的酶的符號改用種名詞頭后第一個(gè)字母（小寫）代替三字母中最后一個(gè)字母如： Haemophilus parainfluenzae 的二種酶為： HpaⅠ 、 HpaⅡ 。 ? （ 2）、限制酶的分類： ? 第一型為單一多功能酶，由三種不同的亞基組成，輔因子為 ATP、 Mg2+及 S腺苷蛋氨酸，其甲基化位點(diǎn)與識別位點(diǎn)相一致，切割后產(chǎn)生的 DNA片段 5‘末端去掉磷?；笮纬傻牧u基末端不能作為多核苷酸激酶磷酸化的底物，所以不宜作為工具酶。它是基因工程的理想工具酶。具有特定識別順序，甲基化位點(diǎn)與識別位點(diǎn)相一致，其功能還有待研究。 ? 其切割 方式有三種： ? EcoRⅠ ： 5’— GAATTC— 3’ ? 3’— CT TAAG— 5’ ? 5’— G AA TTC— 3’ ? G— 5’ 3’— CTT AA Hind Ⅲ ： 5’— NAAGCTTN—