【正文】 位技術(shù)員進行序列分析結(jié)果確認(rèn)并填寫附表3。 DNA測序：使用ABI9700熱循環(huán)儀進行CLIP測序反應(yīng)。 HIV1 基因型系統(tǒng)主要包括如下步驟：：在樣品制備區(qū)生物安全柜中使用QIAamp viralRNA Mini Kit或其它商品化試劑盒提取血漿中的RNA。：,病毒載量≥1000 拷貝/毫升。 HIV1基因型系統(tǒng)是最早經(jīng)過美國FDA批準(zhǔn)的用于HIV耐藥檢測方法，從含有病毒的血漿中提取病毒RNA,然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在同一個反應(yīng)體系中完成PCR擴增反應(yīng)，最后用熒光標(biāo)記測序產(chǎn)物并用自動的激光檢測裝置來檢測。 TRUGENE174。 出具耐藥報告：由具體檢測人填寫耐藥檢測結(jié)果（附表4）并由復(fù)核人復(fù)核后簽字。當(dāng)耐藥毒株在個體內(nèi)病毒群體中的比例低于10%～20%時，通常檢測不到其存在。根據(jù)耐藥突變位點得到某種藥物的單分值，然后累計得到該藥物的總分值，按照總分值來判斷耐藥的程度，0～9分為敏感，10～14分為潛在耐藥，15～29分為低度耐藥，30～59分為中度耐藥,60分以上為高度耐藥。以美國斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫使用為例，首先進入該數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站，點擊HIV db PROGRAM框進入下一頁面，選擇ANALYZE SEQUENCES 框進入序列提交頁面；可將整理好的文本格式序列直接粘貼在Text Input 框中，也可點擊Text File Upload 框中的瀏覽鍵上傳序列文本文件；可輸入Identifier、Date等基本信息，點擊右下角ANALYZE鍵，開始進行耐藥位點分析。耐藥相關(guān)的基因突變一般分基因區(qū)報告，如將蛋白酶（PRO）和逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）兩個基因區(qū)的基因突變分開報告。附件9中給出ChromasPro ,BioEdit,MEGA4軟件操作程序。其中，用于序列清理、拼接和編輯的軟件為ChromasPro/Sequencher、BiEdit及MEGA4。經(jīng)過測序后獲得的核酸序列，在進行耐藥分析以前，需要對序列進行初步的質(zhì)量評估、拼接、混合堿基判讀、清理和質(zhì)量控制等一系列流程。將擴增產(chǎn)物、dNTP、ddNTP、測序引物、緩沖液、Taq酶和適量滅菌純水加入反應(yīng)管中，置于擴增儀上，按照設(shè)定的程序進行測序反應(yīng)，在測序儀中讀取序列數(shù)據(jù)?？梢栽诒緦嶒炇覂?nèi)測序，也可以送到有資質(zhì)的商業(yè)測序公司進行。然后吸取5μlPCR產(chǎn)物加入上樣孔，以5V/cm電壓電泳20～30分鐘，待溴酚藍(lán)或顯色物遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳，將凝膠置于凝膠成像分析儀內(nèi)觀察結(jié)果并照相保存。表52第二輪PCR：一個反應(yīng)體系配制（總體積為50μl）成分（μl）擴增混合液上游引物下游引物ddH2O第一輪PCR產(chǎn)物2518（2）擴增產(chǎn)物鑒定制備瓊脂糖凝膠（%～1%），～，加入100ml 1TBE，加熱熔化，冷卻至60℃后加入5μl無生物污染核酸染料(如GoodView 或替代物SYBRGreen)。表51第一輪PCR：一個反應(yīng)體系配制（總體積為25μl）成分體積（μl）10*bufferMgCl2dNTP上游引物下游引物逆轉(zhuǎn)錄酶Taq酶RNA酶抑制劑ddH2ORNA模板第二輪PCR反應(yīng)總體系為50μl，配制體系見表43，運行程序是：94℃ 5分鐘；94℃ 30秒，63℃ 30秒，72℃ ，30循環(huán)。第一輪PCR運行程序是：50℃ 30分鐘，95℃ 5分鐘；94℃ 30秒，55℃30秒，72℃2分30秒，30循環(huán)。建議使用RTPCR一步法試劑進行第一輪擴增反應(yīng)。將RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、緩沖液和適量無RNA酶的超純水加入反應(yīng)管中，在適宜溫度下進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。實驗中應(yīng)加陽性和陰性外對照，提取RNA時應(yīng)注意防止RNA降解。目前市場上有多種核酸提取試劑盒，可選擇適合的一種，按照試劑盒說明書操作。（2）主要試劑：實驗室自建方法需配置病毒核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增和測序反應(yīng)等步驟所需的試劑。建議先使用B亞型引物進行擴增，如果擴增效率不高，改用BC亞型引物進行擴增，還可以根據(jù)實際擴增情況使用美國CDC推薦引物進行擴增。，BC，AE等主要亞型毒株?！?000拷貝/毫升樣品擴增效率應(yīng)大于85%。（Inhouse）自建基因型耐藥檢測方法應(yīng)按照實驗室認(rèn)可體系文件中非標(biāo)方法的確認(rèn)程序驗證或根據(jù)WHO推薦的檢測認(rèn)證方法認(rèn)證后使用。 HIV1基因型半自動檢測方法和各實驗室根據(jù)工作和研究需要自建的（Inhouse或Homebrew）方法。 收到的DBS應(yīng)存放在20℃或80℃冰箱里。按HIV1基因型耐藥檢測樣品送檢及接收單（附表1）核對樣品數(shù)量，檢查樣品狀況。 。濕度指示卡變成粉紅色時，應(yīng)更換濕度指示卡和干燥劑袋。 ℃或以下。 DBS于室溫下自然干燥至少4小時（在潮濕氣候下至少24小時），嚴(yán)禁加熱和堆疊血片，避免濾紙標(biāo)本的相互污染。，使用移液器從前述采集的抗凝血樣品管中吸取約80μl血樣，對準(zhǔn)濾紙片印圈的中心處，將血樣滴在濾紙上。，大約每孔需要6080ul全血，保證滴滿圓圈。如果用末梢血制備DBS，采集部位為足弓、耳垂或手指。、泄漏及污染。：根據(jù)血漿檢測時間而定，4天內(nèi)可在4℃暫時保存，3個月以內(nèi)應(yīng)凍存于20℃以下，3個月以上應(yīng)置于70℃以下。、凝血的樣品，應(yīng)重新采樣送檢；如果樣品已經(jīng)融化，4℃保存并盡快檢測，記錄凍融一次。如運輸時間超過24小時，應(yīng)使用干冰以保持血漿處于冷凍狀態(tài)。（附表1）。 獲取信息：按要求填寫HIV1基因型耐藥檢測樣品送檢及接收單，包括采集對象的基本信息和流行病學(xué)資料，抗病毒藥物使用情況，病毒載量檢測結(jié)果（附表1）。，上層即為血漿，吸出并分裝到無菌、聚丙烯螺口、已貼上樣品編號的凍存管中（無RNA酶），注明分裝時間。 樣品采集量：通?？紤]該樣品進行多項檢測（如CD4細(xì)胞與病毒載量）所需的樣品總量，一般應(yīng)采集全血8～10ml，采集的樣品量應(yīng)盡可能與定量采血管的刻度一致，采集量過多或不足，會造成血液凝固或被稀釋。：采用EDTA（乙二胺四乙酸）或ACD（枸櫞酸鈉），不要使用肝素，肝素是Taq酶的強抑制劑，且在核酸提取過程中很難除去。在缺乏上述兩種樣品類型時，在保證血清樣品質(zhì)量的條件下，也可用于耐藥性檢測，其檢測結(jié)果作為參考。：記錄紙及記號筆等。、電泳儀。：對擴增產(chǎn)物鑒定和進行數(shù)據(jù)分析 2～8℃和20℃冰箱。:帶濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）、無粉手套、一次性吸水紙。 75%乙醇和移動紫外消毒燈。 20℃冰箱。：第一輪PCR擴增和第二輪PCR反應(yīng)模板添加。 專用辦公用品：記錄紙及記號筆等。加樣器1套（20μL 、200μL、1000μL）。：用于核酸提取和第一輪PCR反應(yīng)液配制。:有濾芯的一次性吸頭（無DNA、RNA酶）、無粉手套、一次性吸水紙。 75%乙醇和移動紫外消毒燈。 混勻器。實驗室1（試劑準(zhǔn)備區(qū)）試劑儲存主反應(yīng)混合液制備實驗室3（擴增區(qū)）第一輪PCR擴增和第二輪PCR反應(yīng)模板添加實驗室2（樣品處理區(qū)）樣品接受、儲存、RNA提取和第一輪PCR反應(yīng)液配制實驗室4（產(chǎn)物分析區(qū)）第二輪PCR擴增、電泳分析和測序反應(yīng)樣品血漿、全血、濾紙片干血斑圖1 HIV1基因型耐藥檢測實驗室具體分區(qū)與流程示例圖（來自WHO）各區(qū)的功能及所需的基本儀器及材料如下：：用于擴增試劑的儲備、配制和分裝。不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。核酸擴增前區(qū)包括設(shè)在不同房間或區(qū)域的試劑準(zhǔn)備區(qū)和樣品制備區(qū)；核酸擴增后區(qū)包括設(shè)在不同的房間或區(qū)域的擴增區(qū)和擴增產(chǎn)物分析區(qū)（圖1）。第三章實驗室環(huán)境與實施依據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)【2010】194號）》、《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范（衛(wèi)醫(yī)發(fā)【2003】8號）》和《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2009年版）》的相關(guān)要求設(shè)置實驗室。、簽發(fā)人復(fù)核人應(yīng)具備對檢測過程進行分析、發(fā)現(xiàn)問題與解決問題的能力。第二章人員要求HIV1基因型耐藥檢測人員分為檢驗人、復(fù)核人、簽發(fā)人。規(guī)范HIV1基因型耐藥檢測的方法與程序，保證檢測質(zhì)量，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。其次，對個體在抗病毒治療前進行耐藥檢測，可指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定抗病毒治療方案，保證抗病毒治療的效果；此外，還可對抗病毒治療失敗病人進行耐藥檢測，指導(dǎo)臨床醫(yī)生分析治療失敗原因，并制定補救治療方案。耐藥突變的產(chǎn)生和發(fā)展會影響抗病毒治療的療效。由于艾滋病病毒本身高速復(fù)制及復(fù)制過程中缺乏自我校對功能等原因，易發(fā)生基因突變產(chǎn)生耐藥。本《指南》自發(fā)布之日起實施，解釋權(quán)歸屬中國疾病預(yù)防控制中心。WHO北京辦事處Nicole Seguy，張嵐。本《指南》編寫主持人：蔣巖本《指南》編寫組人員：姚均、邢輝、尚紅、李敬云、鐘平、徐建青、馬艷玲、楊紹敏、韓曉旭、張旻、潘品良、蔣巖、汪寧、康來儀、朱紅、邢文革、肖瑤、邱茂鋒、吳亞松。本《指南》起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心。經(jīng)過編寫組多次修訂、補充和審定，于2013年3月完成《指南》終稿。HIV1基因型耐藥檢測是對操作人員、實驗室環(huán)境和設(shè)備有很高要求的分子生物學(xué)技術(shù)，為了對開展該項檢測工作的實驗室進行系統(tǒng)的技術(shù)和質(zhì)量控制指導(dǎo)，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，特制定《HIV1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南》（以下簡稱《指南》）。HIV1基因型耐藥檢測及質(zhì)量保證指南(2013年版)Guideline for HIV1genotyping drug resistance testing and quality assurance中國疾病預(yù)防控制中心2013年3月20日前言隨著我國艾滋病抗病毒治療工作的日益深化，HIV1基因型耐藥檢測顯示出越來越重要的作用，開展耐藥檢測的實驗室也日益增多。截至2012年底，共有30余家實驗室從事HIV1基因型耐藥檢測，未來還將有更多的實驗室參與其中。本指南自2011年12月開始編寫，參與編寫的人員為我國實驗室檢測、抗病毒治療領(lǐng)域的專家和有富有實踐經(jīng)驗的檢測人員，同時聘請WHO和美國疾病預(yù)防控制中心的專家作為技術(shù)顧問，并參考了大量國內(nèi)外相關(guān)學(xué)術(shù)文獻及技術(shù)指導(dǎo)手冊?！吨改稀贩譃榘苏?，包括：HIV1基因型耐藥檢測的人員要求、實驗室環(huán)境與設(shè)置、樣品管理、檢測技術(shù)、質(zhì)量控制和生物安全。本《指南》參加編寫單位：中國醫(yī)科大學(xué)，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，上海