【正文】 RNA。15．概述分子雜交的概念和應(yīng)用領(lǐng)域。④ 單鏈片段的復(fù)雜度，在片段大小相似的情況下，片段內(nèi)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)越多，或者說復(fù)雜度越小，越容易形成互補(bǔ)區(qū)，復(fù)性的速度就越快。③ 單鏈片段的長度，單鏈片段越大，擴(kuò)散速度越慢，鏈間錯(cuò)配的概率也越高。所以，核酸復(fù)性時(shí)溫度不宜過低，Tm25℃是較合適的復(fù)性溫度。對(duì)單鏈DNA進(jìn)行電泳時(shí)，常使用上述變性劑。④ 變性劑。高pH下，堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的有力，DNA完全變性。分子生物學(xué)研究工作中需核酸變性時(shí)，常采用離子強(qiáng)度較低的溶液。離子強(qiáng)度較低的介質(zhì)中，Tm較低。,(1SSC)中，經(jīng)驗(yàn)公式為：（G+C）% =（Tm ） 。13．哪些因素影響Tm值的大?。拷獯穑河绊慣m的因素主要有：① GC對(duì)含量。由于DNA分子的高度不對(duì)稱性，因此旋光性很強(qiáng)，其[a] = 150。變性后，發(fā)生了螺旋線團(tuán)轉(zhuǎn)變，黏度顯著降低；③ 在氯化銫溶液中進(jìn)行密度梯度離心，變性后的DNA浮力密度大大增加，故沉降系數(shù)S增加；④ DNA變性后，堿基的有序堆積被破壞，堿基被暴露出來，因此，紫外吸收值明顯增加，產(chǎn)生所謂增色效應(yīng)。引起DNA變性的因素很多，如高溫、超聲波、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑和某些化學(xué)試劑（如尿素，酰胺)等都能引起變性。其核心作用是既可以作為信息分子又可以作為功能分子發(fā)揮作用。相同點(diǎn):都是由相同種類的核苷酸構(gòu)成的的雙螺旋結(jié)構(gòu)，均是遺傳信息的載體，均含有多個(gè)基因。⑥ 原核生物功能上密切相關(guān)的基因相互靠近，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子，真核生物不存在操縱子。④ 真核生物中為蛋白質(zhì)編碼的大多數(shù)基因都含有內(nèi)含子(有斷裂基因)；原核生物中不含內(nèi)含子。 ② 真核生物有多個(gè)呈線形的染色體；原核生物只有一條環(huán)形染色體。10．真核生物基因組和原核生物基因組各有哪些特點(diǎn)?解答： 不同點(diǎn): ① 真核生物DNA含量高，堿基對(duì)總數(shù)可達(dá)10 11，且與組蛋白穩(wěn)定結(jié)合形成染色體，具有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。雖然兩種超螺旋都能釋放應(yīng)力，但是負(fù)超螺旋時(shí)，如果發(fā)生DNA解鏈（即氫鏈斷開，部分雙螺旋分開）就能進(jìn)一步釋放應(yīng)力，而DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制需要解鏈。9．為什么自然界的超螺旋DNA多為負(fù)超螺旋？解答：環(huán)狀DNA自身雙螺旋的過度旋轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)不足都會(huì)導(dǎo)致超螺旋，這是因?yàn)槌菪龑⑹狗肿幽軌蜥尫庞捎谧陨硇D(zhuǎn)帶來的應(yīng)力。7．有一個(gè)X噬菌體突變體的DNA長度是15μm，而正常X噬菌體DNA的長度為17μm，計(jì)算突變體DNA中丟失掉多少堿基對(duì)？解答：（17–15） 103/ = 103bp8．概述超螺旋DNA的生物學(xué)意義。試計(jì)算人體DNA的總長度是多少？是太陽―地球之間距離( 109 km)的多少倍？已知雙鏈DNA每1000個(gè)核苷酸重1 1018g，求人體DNA的總質(zhì)量。解答： （107/640）= 104nm = 13μm。解答： ① [T] + [C] = 1–– = ；② [T] = ，[C] = ，[A] + [G] = 。3．一個(gè)雙螺旋DNA分子中有一條鏈的成分[A] = ，[G] = ，① 請(qǐng)推測(cè)這一條鏈上的[T]和[C]的情況。DNA的脫氧核糖上無2162。核苷酸和3162。,3162。2．為什么DNA不易被堿水解，而RNA容易被堿水解?解答：因?yàn)镽NA的核糖上有2162。③ 當(dāng)不考慮樹脂的非極性吸附時(shí)，根據(jù)核苷酸負(fù)電荷的多少來決定洗脫速度，則洗脫順序?yàn)镃MPAMP GMP UMP，但實(shí)際上核苷酸和聚苯乙烯陰離子交換樹脂之間存在著非極性吸附，嘌呤堿基的非極性吸附是嘧啶堿基的3倍。3 核酸1．① 電泳分離四種核苷酸時(shí)，通常將緩沖液調(diào)到什么pH？此時(shí)它們是向哪極移動(dòng)？移動(dòng)的快慢順序如何? ② 將四種核苷酸吸附于陰離子交換柱上時(shí)，應(yīng)將溶液調(diào)到什么pH？③ 如果用逐漸降低pH的洗脫液對(duì)陰離子交換樹脂上的四種核苷酸進(jìn)行洗脫分離，其洗脫順序如何？為什么？ 解答：① 的緩沖液，在該pH時(shí)，這4種單核苷酸之間所帶負(fù)電荷差異較大，它們都向正極移動(dòng)，但移動(dòng)的速度不同，依次為：UMPGMPAMPCMP；② ，這樣可使核苷酸帶較多負(fù)電荷，利于吸附于陰離子交換樹脂柱。如是含二硫鍵的蛋白質(zhì)，也必須在測(cè)定其氨基酸排列順序前，拆開二硫鍵，使肽鏈分開，并確定二硫鍵的位置。（5）從有重疊結(jié)構(gòu)的各個(gè)肽的序列中推斷出蛋白質(zhì)中全部氨基酸排列順序。（3）應(yīng)用兩種或兩種以上不同的水解方法將所要測(cè)定的蛋白質(zhì)肽鏈斷裂，各自得到一系列大小不同的肽段。解答：（1）測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸組成。說明C端為Gly－Trp…（4）根據(jù)胰蛋白酶的專一性，得知N端片段為Val－Arg（Lys）…，以（1）、（2）、（3）結(jié)果可知道四肽的順序：N－Val－Arg（Lys）－Trp－Gly－C。（2）LiBH4還原后再水解，水解液中有氨基乙醇，證明肽的C端為Gly。8．當(dāng)一種四肽與FDNB反應(yīng)后，；當(dāng)這四肽用胰蛋白酶水解時(shí)發(fā)現(xiàn)兩種碎片段；其中一片用LiBH4（下標(biāo)）還原后再進(jìn)行酸水解，水解液內(nèi)有氨基乙醇和一種在濃硫酸條件下能與乙醛酸反應(yīng)產(chǎn)生紫（紅）色產(chǎn)物的氨基酸。7．一個(gè)α螺旋片段含有180個(gè)氨基酸殘基，該片段中有多少圈螺旋？計(jì)算該α螺旋片段的軸長。解答：由（2）推出N末端為Ala；由（3）推出Val位于N端第四，Arg為第三，而Thr為第二；溴化氰裂解，得出N端第六位是Met，由于第七位是Leu，所以Phe為第八；由（4），第五為Val。當(dāng)以Sanger試劑處理時(shí)分別得到DNPAla和DNPVal。（2）Sanger試劑處理得DNPAla。 6．由下列信息求八肽的序列。（6）在賴氨酸和精氨酸殘基側(cè)水解肽鍵。若有二硫鍵存在時(shí)還需加什么試劑？（4）在芳香族氨基酸殘基羧基側(cè)水解肽鍵。（2）鑒定肽的氨基末端殘基。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已經(jīng)變性。如加熱引起蛋白質(zhì)沉淀，與重金屬或某些酸類的反應(yīng)都屬于此類。如鹽析或低溫下的乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用蛋白質(zhì)。沉淀機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。蛋白質(zhì)由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩(wěn)定的膠體。變性的本質(zhì)：分子中各種次級(jí)鍵斷裂，使其空間構(gòu)象從緊密有序的狀態(tài)變成松散無序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。3．指出下面pH條件下，各蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中向哪個(gè)方向移動(dòng)，即正極，負(fù)極，還是保持原點(diǎn)？（1）胃蛋白酶（pI ），在pH ；（2）血清清蛋白（pI ），在pH ；（3）α脂蛋白（pI ），在pH ；解答：（1）胃蛋白酶pI ＜環(huán)境pH ，帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)；（2）血清清蛋白pI ＜環(huán)境pH ，帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)；（3）α脂蛋白pI ＞環(huán)境pH ，帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)；α脂蛋白pI ＜環(huán)境pH ，帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。2．%，計(jì)算其最低相對(duì)分子質(zhì)量。被釋放的氨基酸數(shù)目與種類隨反應(yīng)時(shí)間的而變化。肽鏈完全水解后，代表原來C―末端氨基酸的α―氨基醇，可用層析法加以鑒別。肼解法：蛋白質(zhì)或多肽與無水肼加熱發(fā)生肼解，反應(yīng)中除C端氨基酸以游離形式存在外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氨基酸酰肼化物。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的N端殘基序列。在酸性有機(jī)溶劑中加熱時(shí)，N―末端的PTC―氨基酸發(fā)生環(huán)化，生成苯乙內(nèi)酰硫脲的衍生物并從肽鏈上掉下來，除去N―末端氨基酸后剩下的肽鏈仍然是完整的。由于DNS與氨基形成的鍵對(duì)酸水解遠(yuǎn)比肽鍵穩(wěn)定，因此DNS―多肽經(jīng)酸水解后，只有N―末端氨基酸為強(qiáng)烈的熒光物質(zhì)DNS―氨基酸，其余的都是游離氨基酸。由于DNFB與氨基形成的鍵對(duì)酸水解遠(yuǎn)比肽鍵穩(wěn)定，因此DNP―多肽經(jīng)酸水解后，只有N―末端氨基酸為黃色DNP―氨基酸衍生物，其余的都是游離氨基酸。2 蛋白質(zhì)化學(xué)1．用于測(cè)定蛋白質(zhì)多肽鏈N端、C端的常用方法有哪些？基本原理是什么？解答：（1） N末端測(cè)定法：常采用―二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。①―二硝基氟苯(DNFB或FDNB)法：多肽或蛋白質(zhì)的游離末端氨基與―二硝基氟苯（―DNFB）反應(yīng)（Sanger反應(yīng)），生成DNP―多肽或DNP―蛋白質(zhì)。② 丹磺酰氯(DNS)法：多肽或蛋白質(zhì)的游離末端氨基與與丹磺酰氯（DNS―Cl）反應(yīng)生成DNS―多肽或DNS―蛋白質(zhì)。③ 苯異硫氰酸脂（PITC或Edman降解）法：多肽或蛋白質(zhì)的游離末端氨基與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)（Edman反應(yīng)），生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白質(zhì)。④ 氨肽酶法：氨肽酶是一類肽鏈外切酶或叫外肽酶，能從多肽鏈的N端逐個(gè)地向里切。（2）C―末端測(cè)定法：常采用肼解法、還原法、羧肽酶法。② 還原法：肽鏈C端氨基酸可用硼氫化鋰還原成相應(yīng)的α―氨基醇。③ 羧肽酶法：是一類肽鏈外切酶，專一的從肽鏈的C―末端開始逐個(gè)降解，釋放出游離的氨基酸。根據(jù)釋放的氨基酸量（摩爾數(shù)）與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，便可以知道該肽鏈的C―末端氨基酸序列。%%，問其最低相對(duì)分子質(zhì)量是多少？解答：（1）血紅蛋白：（2）酶：因?yàn)榱涟彼岷彤惲涟彼岬南鄬?duì)分子質(zhì)量相等，所以亮氨酸和異亮氨酸的殘基數(shù)之比為：%:%=2:3，因此，該酶分子中至少含有2個(gè)亮氨酸，3個(gè)異亮氨酸。4．何謂蛋白質(zhì)的變性與沉淀？二者在本質(zhì)上有何區(qū)別？解答：蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：①?生物學(xué)活性消失； ②?理化性質(zhì)改變：溶解度下降，黏度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)酶的作用敏感，易被水解。如果在蛋白質(zhì)溶液中加入適當(dāng)?shù)脑噭?，破壞了蛋白質(zhì)的水膜或中和了蛋白質(zhì)的電荷，則蛋白質(zhì)膠體溶液就不穩(wěn)定而出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。蛋白質(zhì)的沉淀可以分為兩類：（1）可逆的沉淀：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)未發(fā)生顯著的變化，除去引起沉淀的因素，蛋白質(zhì)仍能溶于原來的溶劑中，并保持天然性質(zhì)。（2）不可逆沉淀：蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)變性而沉淀，不再能溶于原溶劑。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在，并不析出。5．下列試劑和酶常用于蛋白質(zhì)化學(xué)的研究中：CNBr，異硫氰酸苯酯，丹磺酰氯，脲，6mol/L HCl β巰基乙醇，水合茚三酮，過甲酸，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，其中哪一個(gè)最適合完成以下各項(xiàng)任務(wù)？（1）測(cè)定小肽的氨基酸序列。（3）不含二硫鍵的蛋白質(zhì)的可逆變性。（5）在甲硫氨酸殘基羧基側(cè)水解肽鍵。解答：（1）異硫氰酸苯酯；（2）丹黃酰氯；（3）脲；巰基乙醇還原二硫鍵；（4）胰凝乳蛋白酶；（5）CNBr；（6）胰蛋白酶。（1）酸水解得 Ala，Arg，Leu，Met，Phe，Thr，2Val。（3）胰蛋白酶處理得Ala，Arg，Thr 和 Leu，Met，Phe，2Val。（4）溴化氰處理得 Ala，Arg，高絲氨酸內(nèi)酯，Thr，2Val，和 Leu，Phe，當(dāng)用Sanger試劑處理時(shí)，分別得DNPAla和DNPLeu。所以八肽為：AlaThrArgValValMetLeuPhe。解答：180/=50圈，50=27nm，該片段中含有50圈螺旋，其軸長為27nm。試問這四肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由哪幾種氨基酸組成的？解答：（1）四肽與FDNB反應(yīng)后，證明N端為Val。（3）水解液中有在濃H2SO4條件下能與乙醛酸反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物的氨基酸，說明此氨基酸為Trp。9．概述測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的基本步驟。（2）蛋白質(zhì)的N端和C端的測(cè)定。（4）分離提純所產(chǎn)生的肽，并測(cè)定出它們的序列。如果蛋白質(zhì)含有一條以上的肽鏈，則需先拆開成單個(gè)肽鏈再按上述原則確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)。拆開二硫鍵可用過甲酸氧化，使胱氨酸部分氧化成兩個(gè)半胱氨磺酸。雖然pH ，但pH過高對(duì)分離不利。靜電吸附與非極性吸附共同作用的結(jié)果使洗脫順序?yàn)椋篊MP AMP UMP GMP。OH基，在堿作用下形成2162。環(huán)磷酸酯，繼續(xù)水解產(chǎn)生2162。核苷酸。OH基，不能形成堿水解的中間產(chǎn)物，故對(duì)堿有一定抗性。② 互補(bǔ)鏈的[A]，[G]，[T]和[C]的情況。4．對(duì)雙鏈DNA而言，① 若一條鏈中(A + G)/(T + C)= ，則互補(bǔ)鏈中和整個(gè)DNA分子中(A+G)/(T+C)分別等于多少？② 若一條鏈中(A + T)/(G + C)= ，則互補(bǔ)鏈中和整個(gè)DNA分子中(A + T)/(G + C)分別等于多少 ？解答：① 設(shè)DNA的兩條鏈分別為α和β則： Aα= Tβ，Tα= Aβ，Gα= Cβ，Cα= Gβ，因?yàn)椋?Aα+ Gα)/（Tα+ Cα）= (Tβ+ Cβ)/（Aβ+ Gβ）= ， 所以互補(bǔ)鏈中（Aβ+ Gβ）/（Tβ+ Cβ）= 1/ =；在整個(gè)DNA分子中，因?yàn)锳 = T， G = C，所以，A + G = T + C，（A + G）/（T + C）= 1；② 假設(shè)同（1），則Aα+ Tα= Tβ+ Aβ，Gα+ Cα= Cβ+ Gβ，所以，（Aα+ Tα）/（Gα+ Cα）=（Aβ+ Tβ）/（Gβ+ Cβ）= ；在整個(gè)DNA分子中，（Aα+ Tα+ Aβ+ Tβ）/（Gα+Cα+ Gβ+Cβ）= 2（Aα+ Tα）/2（Gα+Cα）= 5．T7噬菌體DNA(雙鏈BDNA)107，計(jì)算DNA鏈的長度(設(shè)核苷酸對(duì)的平均相對(duì)分子質(zhì)量為640)。6．如果人體有1014個(gè)細(xì)胞， 109個(gè)堿基對(duì)。解答：每個(gè)體細(xì)胞的DNA的總長度為： 109 = 109 nm = ，人體內(nèi)所有體細(xì)胞的DNA的總長度為：1014 = 1011km，這個(gè)長度與太陽―地球之間距離（109 km）相比為： 1011/ 109 = 99倍，每個(gè)核苷酸重1 1018g/1000 = 1021g，所以，總DNA 1023 1021 = 102 = 640g。解答： ① 超螺旋DNA比松弛型DNA更緊密，使DNA分子的體積更小，得以包裝在細(xì)胞內(nèi)；② 超螺旋會(huì)影響雙螺旋分子的解旋能力,從而影響到DNA與其他分子之間的相互作用；③ 超螺旋有利于DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及表達(dá)調(diào)控。雙螺旋過度旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致正超螺旋，而旋轉(zhuǎn)不足將導(dǎo)致負(fù)超螺旋。因此自然界環(huán)狀DNA采取負(fù)超螺旋，這可以通過拓?fù)洚悩?gòu)酶的操作實(shí)現(xiàn)。原核生物