浙江大學(xué)膠體金免疫標(biāo)記培訓(xùn)班資料-展示頁
2025-07-03 04:16本頁面
【正文】 。對(duì)于理化性質(zhì)不確定的蛋白這一步尤為重要。把分子量過小的蛋白與其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）結(jié)合后，能制備出穩(wěn)定性更佳的探針。蛋白分子量過小（30 kD），形成的蛋白復(fù)合體往往是不穩(wěn)定，可短時(shí)間內(nèi)失活。（2）使蛋白分子盡量分散為單體，凍干蛋白或高濃度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚為多聚體大分子，可同時(shí)與多個(gè)膠體金粒子結(jié)合，影響標(biāo)記的靈敏度和定量分析。但在實(shí)際的膠體金探針制備中，一般膠體金調(diào)整為pH=PI+，這樣蛋白帶正電，有利于結(jié)合更穩(wěn)定。膠體金粒子對(duì)蛋白的吸附作用取決于pH值，這是因蛋白的凈電荷取決于溶液的pH值，在pH=pI時(shí)為中性。二、蛋白金復(fù)合體的制備一般認(rèn)為膠體金粒子表面為一層AuCl2，因此，粒子表面帶有負(fù)電荷，這種負(fù)電荷粒子之間相互排斥，形成穩(wěn)定懸浮的膠體金溶液。(2) 膠體金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存12個(gè)月。注 意：(1) 由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。檸檬酸三鈉法制備1230 nm膠體金(Frens, 1973)(1) 取250 ml三角瓶一個(gè)，加100 ml雙蒸水及1 ml 1%氯化金，加熱沸騰；檸檬酸鈉(ml)膠體金(nm)51241632430(2) 取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中。 ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作請(qǐng)帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進(jìn)行中和)。檸檬酸鈉（ml）單寧酸（ml）膠體金（nm）45000342000445006412084701041016白磷還原法制備5 nm膠體金(1) 取250 ml三角瓶一個(gè)，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金， M K2CO3將溶液調(diào)至中性（）。(3) 將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。(2) 取一50 ml燒杯，加入4 ml 1％檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25 mM K2CO3。但無論無何，在保存較長時(shí)間后應(yīng)進(jìn)行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期。制備好的膠體金保存壽命較長，可4℃保存6個(gè)月以上或室溫下保存12個(gè)月。配制各種試劑時(shí)均使用雙蒸水， mm微孔濾膜過濾后使用。氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（），因此在配制氯化金溶液時(shí)一次配完， ml試管分裝為1 ml保存（20℃）。除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。但制備大體積的膠體金時(shí)，膠體金粒子的誤差也同時(shí)增加。雙標(biāo)記或制備510 nm的膠體金時(shí)建議使用該方法。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對(duì)一致、直徑3～16nm的膠體金。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。浙江大學(xué)電子顯微鏡室 浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)培訓(xùn)班技術(shù)資料胡東維 洪 健 徐 穎浙江大學(xué)2001年10月24 / 26一、膠體金的制備根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在330nm范圍內(nèi)。在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中最初還原試劑和還原核的數(shù)量。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。因此一般膠體金探針均使用該方法進(jìn)行?！サ腍2O2能夠去除這些殘基。利用檸檬酸為還原劑，可以制備12～150 nm直徑的膠體金。因此做單標(biāo)記時(shí)，建議使用該方法制備1216 nm直徑的膠體金。磷易燃且有毒，制備的殘液需進(jìn)一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時(shí)可硅化處理（1％雙氯硅烷/氯仿浸泡1小時(shí)，烘干）。三角瓶可反復(fù)多次使用，不用時(shí)應(yīng)密封保存，以防污染。當(dāng)出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。單寧酸/檸檬酸鈉法制備3～16 nm膠體金(1) 取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1％氯化金，預(yù)熱至60～70℃。預(yù)熱至60～70℃。 ml時(shí)，對(duì)pH的影響不大，K2CO3可以省略。自然冷卻。(2) ml飽和磷/ ml試管中， ml乙醚，混勻。(3) 室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻?；靹颍俦３址序v30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時(shí)，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時(shí)，則顏色偏向紫色。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。但決不可保存在0℃以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。金顆粒表面可以包被一層生物大分子（如蛋白）來穩(wěn)定和保護(hù)這些粒子，以免受外來電解質(zhì)的影響而相互凝聚在一起。由于在pH=pI時(shí)蛋白溶解度最小，因此這時(shí)它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。膠體金探針?biāo)玫鞍妆仨氁?jīng)過前處理，其目的在于（1）去除高濃度的鹽分，高濃度的鹽分往往干擾蛋白與膠體金的吸附結(jié)合，或?qū)е履z體金粒子的凝聚，這一步往往采用低濃度緩沖液中進(jìn)行。（3）使蛋白具有適當(dāng)?shù)姆肿恿?。而分子量過大時(shí)，被認(rèn)為影響探針的靈敏度，特別是已知蛋白的結(jié)構(gòu)與活性中心的情況下，去除對(duì)活性武影響的結(jié)構(gòu)部分是提高標(biāo)記靈敏度，延長探針壽命（防止凝集）的有效辦法。當(dāng)?shù)鞍浊疤幚硗瓿珊?，接著要確定膠體金與蛋白結(jié)合的最佳pH值。過量的蛋白與不同pH值得膠體金結(jié)合后，只有某一特定pH值能夠形成結(jié)合最穩(wěn)定的探針。不同蛋白的適宜pH范圍的寬窄大不相同。但有些探針的實(shí)際情況并不完全如此，最穩(wěn)定發(fā)探針并不完全代表活性最好。在確定最佳pH值后，最后要確定最小蛋白量，即能夠形成穩(wěn)定探針的蛋白的最小量。因?yàn)樘结樔芤褐械挠坞x蛋白容易搶先與標(biāo)記位點(diǎn)結(jié)合，起到“封閉”（Blocking）作用，而膠體金探針標(biāo)記不上。這里需要特別指出的是，使用不同直徑的膠體金與同一蛋白結(jié)合時(shí)，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定變化?？寡宓那疤幚硪话憧寡逯蠭gG的含量為1025%，而絕大部分為其它蛋白。因此需去除其中多數(shù)雜蛋白。如果你的實(shí)驗(yàn)室在蛋白純化方面有很強(qiáng)的技術(shù)支持，高度純化后效果會(huì)更好。其基本步驟如下：(1) ml；(2) 加生理鹽水（％ NaCl） ml，混勻；(3) 逐滴加入飽和 (NH4)2SO4 ml，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h；(4) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清；(5) ml生理鹽水重懸浮，混勻；(6) ml飽和 (NH4)2SO4，充分振蕩混勻，4℃靜置1 h；(7) 10000 rpm/min離心20 min，棄上清；(8) 重復(fù)5～8步驟一次；(9)
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