【正文】 失敗，質(zhì)粒沒析出； 3）加劑問題電泳失?。?）電壓太高 2）沒加染色劑 3）膠穿孔 4）電泳時間過長12. 電泳緩沖液使用一定時間后出現(xiàn)DNA在凝膠中跑不動現(xiàn)象的原因，有何解決辦法？原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；解決方法：； 13. 電泳的指示劑和染色劑有何區(qū)別，各自的作用是什么？指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）作用：①預(yù)知電泳的速率及方向；②使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣；③一些高濃度蔗糖或其它物質(zhì)增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠[EB]、硝酸銀、Goldview染料）作用：呈現(xiàn)出核酸電泳后的帶型。堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分變性。Southern雜交影響因子1）、目的DNA在總DNA中所占的比例2）、探針的大小和標記效率3）、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量4）、探針與靶DNA的同源性8. 基因組文庫的構(gòu)建過程？如何確定文庫的大?。炕蚪M文庫的構(gòu)建過程：1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；2）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（常為4堿基識別位點）進行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當(dāng)長度的DNA片斷（根據(jù)載體的要求）； 4）載體的酶切、回收；5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；6）將重組子導(dǎo)入宿主細胞7）文庫的鑒定、收集、保存；確定文庫大小的方法：以在構(gòu)建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質(zhì)量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N（即文庫大?。┲g的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f ) 其中： N：文庫所需的總克隆數(shù)； P：任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕?； f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。標記類型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針根據(jù)標記物的不同：可分放射性標記探針和非放射性標記探針；雙鏈DNA探針標記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法；7. Southern雜交一般過程及影響雜交因素。初始模板量X0的對數(shù)值與C(T) 值之間呈線性關(guān)系：log X0= log(1+Ex) *Ct+ log N Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段時到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如后圖所示，圖僅供參考）Threshold line C(t) value C(t) value +/閾值線Ct值Ct值6. 分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈DNA的標記方法是哪兩種？探針的標記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標記法，PCR標記法，體外轉(zhuǎn)錄標記法。(6)PCR反應(yīng)程序設(shè)定：變性溫度和時間、引物退火溫度Tm與時間、引物延伸溫度與時間和循環(huán)數(shù)4. PCR引物設(shè)計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，如何設(shè)計擴增引物？（關(guān)于如何設(shè)計這個問題，靠自己了）引物設(shè)計原則： G+C含量4555%； Tm值高于55； 引物特異性； 引物擴增跨度； 是否形成引物二聚體5. 定量PCR的原理？Ct值的含義。(4)引物濃度：，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；167。(3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質(zhì)則難以成功。mol/L，不能低于20181。酶的活性；167。濃度低，擴增產(chǎn)物不夠； 179。(1)Taq酶：常用1U/25181。PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據(jù)堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結(jié)合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導(dǎo)下合成與模板DNA互補的新鏈，實現(xiàn)DNA的擴增。 離子濃度：離子濃度高_ 電流大_發(fā)熱快_膠溶解 220。凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳4）電泳緩沖液 220。電壓太高則結(jié)果不準確常用3~5V/CM3）支持物介質(zhì) 216。分子構(gòu)型：超螺旋解螺旋2）電場：直流電場 216。分子的大?。盒t快 216。 在堿性環(huán)境下，核酸分子帶負電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)達到分離不同大小核酸分子的目的。復(fù)性的應(yīng)用：核酸的雜交，分子擴增）第二章（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復(fù)性。DNA復(fù)性的程度、速率與復(fù)性過程的條件有關(guān)，也與它本身的組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)：分子量越大復(fù)性越難。 DNA復(fù)性及其影響因素。根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為三類：l 轉(zhuǎn)錄并翻譯編碼蛋白質(zhì)的基因: 包括結(jié)構(gòu)蛋白基因、編碼酶的基因、調(diào)節(jié)基因l 轉(zhuǎn)錄但不翻譯產(chǎn)物的基因: 包括tRNA、rRNAl 不轉(zhuǎn)錄但有功能的DNA區(qū)段: 如啟動子、操縱基因 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質(zhì)有何變化？引起核酸變性的因素：溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。 DNA的分子特性與利用 原核生物和真核生物的基因表達調(diào)控有何差別？1）原核基因表達調(diào)控的三個水平：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控原核基因表達調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉(zhuǎn)基因食品。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植已有數(shù)年， 食用轉(zhuǎn)基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉(zhuǎn)基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經(jīng)過國家法律認可， 食品衛(wèi)生部門和環(huán)境部門的嚴格檢測。人們對轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要擔(dān)憂在于環(huán)境方面。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和發(fā)展中起到了積極作用?；蚬こ淘谑称饭I(yè)上有何應(yīng)用發(fā)展？主要是通過基因重組，使各種轉(zhuǎn)基因生物提高生產(chǎn)谷氨酸、調(diào)味劑、酒類和油類等有機物的產(chǎn)率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價值。試述基因工程的主要研究內(nèi)容。特征：具跨越天然物種屏障的能力?；蚬こ淘韽?fù)習(xí)題思考題基因工程緒論基因工程的定義與特征。定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細胞內(nèi)，穩(wěn)定地復(fù)制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產(chǎn)人類急需的藥品、食品、工業(yè)品等。 強調(diào)了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。1）、目的基因的分離2）、DNA的體外重組（載體、受體系統(tǒng)等）3）、重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞及其篩選4）、基因在受體細胞內(nèi)的擴增、表達、檢測及其分析。轉(zhuǎn)基因是一把雙刃劍，請客觀談?wù)剬D(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因食品安全性的認識。首先，通過該項技術(shù)可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；第二，延長食品保存時間或增加營養(yǎng)成分；第三，將抗蟲防菌基因轉(zhuǎn)入到作物中，使作物本身產(chǎn)生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農(nóng)藥的使用量，有利于環(huán)境保護；第四，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因食物在醫(yī)學(xué)方面得到廣泛研究和應(yīng)用。外源基因的導(dǎo)入可能會造就某種強勢生物， 產(chǎn)生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態(tài)平衡和生物多樣性，也即轉(zhuǎn)基因生物存在潛在的環(huán)境安全問題。只有測試合格了，才能投放市場。第一章2）真核生物基因表達的特點：l 1．基因組DNA存在的形式與原核生物不同；l 2．真核生物中轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進行；l 3．基因表達具有細胞特異性或組織特異性；l 4．真核基因表達的調(diào)控在多個水平上進行：DNA水平的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控、蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控； 什么是基因？根據(jù)基因的產(chǎn)物，基因可分為哪三類？基因是具有生物學(xué)功能的、在染色體上占據(jù)一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。DNA變性后，它的一系列性質(zhì)發(fā)生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應(yīng)）, 粘度降低等，如DNA增加25－40%. %。變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。濃度越大，復(fù)性越容易。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復(fù)性。 基因工程操作的基本技術(shù)1. DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。2. DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？1）分子本身的影響 216。帶電荷數(shù)：多則快 216。電壓高則快 216。種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠 216。 pH值：偏堿性，帶負電荷 220。種類：TAE、TBE、TPE、TNE3. PCR的原理和主要反應(yīng)過程，并分析影響PCR擴增的影響因素。影響PCR擴增的影響因素：167。L 179。濃度高，非特異性擴增增加； 179。(2)dNTP的濃度：常用100200181。mol/L，特異性、保真性；167。使用量從幾個ng到100ng.167。(5)Mg2+濃度：常用 ； 影響：酶的活性、引物模板退火、特異性167。原理：通過實時檢測PCR每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物相對應(yīng)的熒光信號，來實現(xiàn)對起始模板進行定量及定性的分析。探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；按標記物的不同：放射性標記探針和非放射性標記探針。Southern雜交操作步驟:(1) 用限制性內(nèi)切酶酶切DNA, 經(jīng)凝膠電泳分離各酶切片段； (2) 轉(zhuǎn)膜：將DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；(3) 預(yù)雜交：封阻濾膜上非特異性位點； (4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結(jié)合；(5) 洗脫：去除非特異性結(jié)合的探針；(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。9. 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？10. 一般質(zhì)粒DNA的構(gòu)型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？超螺旋質(zhì)粒DNA、開環(huán)質(zhì)粒DNA、線狀質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：超螺旋質(zhì)粒DNA線狀質(zhì)粒DNA開環(huán)質(zhì)粒DNA11. 堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，分析影響試驗結(jié)果的各種可能因素。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來構(gòu)型，而線性大分子細菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。第三章 基因克隆的酶學(xué)基礎(chǔ) 限制性核酸內(nèi)切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內(nèi)切酶？（常用II型） 什么是星活性，產(chǎn)生星活性的因素可能有哪些？在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產(chǎn)生非特異性帶，這種活性稱星活性。（這個答案是上屆的，僅供參考）1）DNA的純度：DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。3）溫度 ：不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。（例子和圖幫助大家理解而已）命名規(guī)則：寄主菌屬名的第1個字母＋種名的前兩個字母＋菌株或菌型代號（大寫）＋空白＋發(fā)現(xiàn)序列（羅馬數(shù)字）例子：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序) 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同，有些不同。 不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。向339。不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。 效率：粘性末端平端(100倍)； 185。平端：HaeIIIAluIHinCIISmaI2）連接溫度 185。185。3）反應(yīng)液中的成分： 185。單價離子：150200mM NaCl，提高連接效果； 185。載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。（傳說中的網(wǎng)上答案）低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。平端的連接對于離子濃度很敏感盡可能縮小連接反應(yīng)的體積建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大腸桿菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修飾過的T7 DNA聚合酶 6）逆轉(zhuǎn)錄酶7）Taq DNA聚合酶第四章 基因克隆的載體系統(tǒng) 作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？! 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）； ! 具有合適的篩選標記；! 具有較高的外源DNA的載裝能力；! 具有多克隆位點（MCS）；! 具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點?！?定義：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？A、 化學(xué)法（CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形