new實(shí)驗(yàn)七gst酶親和層析及sds-page-展示頁
2025-06-03 22:58本頁面
【正文】 溶液裝在半透膜（玻璃紙、火綿紙等）制的透析袋里放在蒸餾水 (緩沖液 )中進(jìn)行，可不斷更換蒸餾水，直至雜質(zhì)被除去。 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 7 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 8 ?蛋白質(zhì)用鹽析方法沉淀分離后，還需要脫鹽才能進(jìn)一步精提純。 ? 鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。 一、粗分級(jí)分離 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 6 （ 1）鹽析 (Saltingout) ?向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽 [(NH4)2SO4， Na2SO4，NaCl 等 ]， 使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。工程菌中 GST酶的親和層析分離 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE）鑒定 蛋白質(zhì)分離純化綜合實(shí)驗(yàn) Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 2 Contents 1. 蛋白質(zhì)分離純化 2. 蛋白質(zhì)的鑒定分析 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 3 ?根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。 性 質(zhì) 方 法 ?分子大小 透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾 ?溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀 ?電荷 電泳、離子交換層析 ?吸附性質(zhì) 吸附層析 (羥基磷灰石層析、疏水作用層析 ) ?對(duì)配體分子 親和層析 的生物親和力 蛋白質(zhì)分離純化的方法 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 4 等電點(diǎn)沉淀法 聚乙二醇沉淀法 鹽析法 有機(jī)溶劑沉淀法 熱變性沉淀法 蛋白質(zhì)分離純化 1．電泳法 2．層析法 3．沉淀法 4． 透析、超濾 離心 結(jié)晶 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 5 ? 主要是利用 鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀 等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。常用的鹽析劑是硫酸銨，其鹽析能力強(qiáng)，水中溶解度大，濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)活性喪失。 ?鹽析沉淀的蛋白質(zhì)仍保持天然構(gòu)象，即仍有活性。脫鹽常選用 透析法 或 凝膠過濾 。 透析袋 蛋白質(zhì)溶液 蒸餾水 （ 2）透析 (Dialysis) Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 9 （ 3）等電點(diǎn)沉淀 ?蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關(guān)，隨溶液 pH變化而變化。 ?不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點(diǎn)，因此通過 調(diào)節(jié)溶液 pH到目的蛋白的等電點(diǎn)，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。 ?有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有二： ? 降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子表面可解離基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。 ? 室溫下，有機(jī)溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。 ? 不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機(jī)溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機(jī)溶劑分離不同蛋白質(zhì)。進(jìn)一步提純通常使用高分辨率的 柱層析及電泳 方法。 ?常用電泳方法： PAGE、等電聚焦電泳 (IEF)。 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 12 細(xì)菌中外源 GST酶的分離純化及鑒定 細(xì)菌中外源 GST蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) (IPTG誘導(dǎo) ) 細(xì)菌的裂解（溶菌酶法） GluAragrose beads親和層析 分離 GST蛋白 GST蛋白的 SDSPAGE純度鑒定 綜合實(shí)驗(yàn) Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 13 親和層析的原理 ?親和層析是利用生物分子間所具
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