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生物工程下游技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義-展示頁(yè)

2024-11-15 11:03本頁(yè)面
  

【正文】 典型代表 , 是溶菌酶群中重要研究對(duì)象 , 也是 目前了解最清楚的溶菌酶 。 此種酶對(duì)溶壁小球菌活性較雞蛋清溶菌酶低 , 但對(duì)膠體狀甲殼質(zhì)的分解活性則為雞蛋清的 10倍左右 。 目前 , 從牛 、 馬等的乳汁中已分離出了溶菌酶 , 其理化性質(zhì)與人溶菌酶基本相似 , 但結(jié)構(gòu)尚不清楚 。 在人和許多哺乳動(dòng)物的組織和分泌液中均發(fā)現(xiàn)有該酶存在 。 之后研究人7 員發(fā)現(xiàn)鳥類和家禽的蛋清中,哺乳動(dòng)物的淚、唾液、血漿,植物蘿卜、木瓜、卷心菜等均含有溶菌酶。 雞蛋清中 含 13%~ 15%的蛋白質(zhì), 除了溶菌酶以外,還有其他的蛋白質(zhì),其主要特點(diǎn)分 別 如下: % PI 分子量 kd 說(shuō) 明 糖 蛋 白 卵清蛋白質(zhì) 45 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 80 類卵粘蛋白 28 抑制胰凝乳蛋白酶 卵粘蛋白 - 28 胰蛋白酶的抑制劑 卵糖蛋白 卵巨球蛋白質(zhì) 卵抑制素 抗生物素蛋白質(zhì) 與生物素結(jié)合 黃素蛋白質(zhì) 蛋 白 質(zhì) 溶菌酶 11 未確定蛋白質(zhì) 根據(jù)上表中溶菌酶與其他含量較高的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同,以及溶菌酶本身的特點(diǎn)就可以應(yīng)用等電點(diǎn)沉淀法除去大部分的雜質(zhì),從而得到溶菌酶的粗品。 ?是一種罕見的穩(wěn)定蛋白質(zhì),對(duì)溫度和酸不敏感,在弱堿性條件下穩(wěn)定。 在實(shí)際應(yīng)用中 , 由于 它具有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的能力 , 起到抗菌消炎 、消腫、鎮(zhèn)痛、加快組織修復(fù) 的作用 ,被 廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè) ;由于 溶菌酶本身是一種無(wú)6 毒 、 無(wú)害 、 安全性很高的高鹽基蛋白質(zhì) , 作為天然防腐劑的溶菌酶在食品工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用價(jià)值 ;此外,還被用于飼料工業(yè)、 用于提取微生物細(xì)胞內(nèi)各類物質(zhì)和進(jìn)行原生質(zhì)體制備及融合育種 等科學(xué)研究領(lǐng)域 。 有些革蘭氏陰性菌 , 如傷寒沙門氏菌 、埃希氏大腸桿菌也會(huì)受到溶菌酶的破壞 。 它能 水解細(xì)菌細(xì)胞壁 N乙酰胞壁酸和 N乙酰氨基葡萄糖之間的 β 1,4糖苷鍵, 破壞肽聚糖支架 , 低滲溶液中細(xì)胞 在 內(nèi)部滲透壓的作用下脹裂開 , 引起細(xì)菌裂解 。 5 表 2 酶的提純過(guò)程記錄格式 (模擬的數(shù)據(jù)) 步驟 總體 積 Ml 蛋白濃 度mg/mL 蛋白總量 mg 酶濃度 u/mL 比活力 u/mg 總活力 U 產(chǎn)率 % 提純倍數(shù) 除細(xì)胞粗提液 1000 12 12020 5 0. 416 5000 100 50℃熱變性除雜蛋白 1000 8 8000 4. 8 0. 60 4800 96 硫酸 銨分級(jí)沉淀 250 3 750 11. 0 3. 67 2730 55 離子交換層析 5 7 35 364 52 1820 36. 4 125 親和 層析 4 3 375 500 1500 30 1200 二 、溶菌酶 溶菌酶 ( lysozyme) 是 由 Alexander Fleming在 1922年發(fā)現(xiàn)的一種 有效的抗菌劑,因能選擇性地 溶解微生物細(xì)胞壁 而得名 。 表 2 是采用表格記錄的酶的純化過(guò)程的例子 , 從表中可以看出, 1000mL 的除提液,總酶活 5000u, 經(jīng) 5 步純化,最終獲得 4mL 的純酶,酶活從原來(lái)的,純度提高 1200 倍, 酶活力從原來(lái)的 5000u 減至 1500u,產(chǎn)率為 30%。在酶促反應(yīng)速度曲線上,過(guò)原點(diǎn)做切線,其斜率即為初速度。從 酶促反應(yīng)速度曲線 可知 ,反應(yīng)速度只在最初一段時(shí)間內(nèi)保持恒定,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),由于底物濃度降低,產(chǎn)物反饋抑制,逆反應(yīng)速度加快,酶本身失活等因素,使酶促反應(yīng)速度逐漸下降,最后完全停止。 酶促反應(yīng)體系復(fù)雜,影響酶促反應(yīng)速度的因素很多,包括底物濃度、 酶濃度、產(chǎn)物濃度、 pH 、溫度、抑制劑和激活劑等影響因素。利用比活力的大小可以用來(lái)比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力,是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。比活力為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù),一般用酶活力單位 /mg 蛋白質(zhì)表示。通常用最適條件下酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度來(lái)衡量酶活力的大小,所以酶活力的測(cè)定就是測(cè)定酶促反應(yīng)的速度,即單位時(shí)間內(nèi)底物或產(chǎn)物的濃度變化。 所謂 酶活力是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力??偦盍Φ幕厥章史从沉思兓^(guò)程中 蛋白質(zhì) 活力的損失情況,比活力的提高倍數(shù)則反映了純化方法的效率。 一般先依據(jù) 蛋白質(zhì) 的溶解度性質(zhì),選擇適宜的方法,將目的 蛋白質(zhì) 制得粗 蛋白 ,然后根據(jù) 蛋白質(zhì) 分子的大小、電荷性質(zhì)、親和專一性等,應(yīng)用離心、層析、電泳、結(jié)晶等方法,將 蛋白質(zhì) 純化。在 一定的條件下,用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚砗?蛋白質(zhì) 原料,使 蛋白質(zhì) 充分溶解到溶劑中。如用于藥物篩選用的多達(dá) 300 多種蛋白激酶,現(xiàn)均利用體外 DNA 重組方式大量獲得。 現(xiàn)在,利用動(dòng)植物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù),可以大量獲得原材料,以用于蛋白質(zhì) 的分離純化。同時(shí)也要考慮原料來(lái)源、取材方便經(jīng)濟(jì)等因 素。測(cè)定范圍~ 。此染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后顏色有紅色形式和藍(lán)色形式,最大光吸收由 465nm 變成 595nm,通過(guò)測(cè)定 595nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。計(jì)算公式為: 3 蛋白濃度 ( mg/mL) = ( A215A225) 考馬斯亮藍(lán) G250 法:考馬斯 亮藍(lán) G― 250 存在著兩種不同的顏色形式,紅色和藍(lán)色。選取 215nm 可減少干擾和光散射,用 215 和 225nm 光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比,可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸,核酸在260nm波長(zhǎng)處有最大吸收。 紫外吸收法:大多數(shù)蛋白質(zhì)在 280nm 波長(zhǎng)處有特征的最大吸收,這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故,因此,利用這個(gè)特異性吸收,可以計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。此法比雙縮脲法靈敏得多,適合于測(cè)定 20mg/L~ 400mg/L 含量的蛋白質(zhì)溶液。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng),即 Cu2+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物,然后這個(gè)絡(luò)合物還原磷鉬磷 磷鎢酸試劑(福林 酚試劑),結(jié)果得到深藍(lán)色物 。此外,Cu2+與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物也可以在 310330nm 測(cè)定,比 540nm 處測(cè)定靈敏 10倍以上。 雙縮脲法:蛋白質(zhì)含有多個(gè)肽建,有雙縮脲反應(yīng),在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色化合物,可在 540nm 處比色測(cè)定,其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比,而與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無(wú)關(guān)。 濃度檢測(cè):濃度檢測(cè)是評(píng)估產(chǎn)率的一個(gè)重要因素。一般一種方法檢測(cè)純度并不可靠,故常采用兩種或以上的2 方法來(lái)檢測(cè)純度。雜質(zhì)的含量往 往低于很多常規(guī)的分析方法的檢測(cè)極限。如果在相應(yīng)的方法達(dá)到了單一的區(qū)帶、斑點(diǎn)或只有一個(gè)吸收峰,我們可以認(rèn)為該 蛋白質(zhì) 達(dá)到了相應(yīng)方法的純度,如電泳純、色譜純。如:蛋白激酶常用其催化底物與 P32ATP 的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè),超氧化物歧化酶( SOD)的活性通過(guò)鄰苯三酚法進(jìn)行檢測(cè)。總的要求是快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。對(duì)生物大分子的檢測(cè),主要評(píng)估幾個(gè)方面:活性、純度以及濃度 。 2. 建立相應(yīng)的檢測(cè)手段 建立滿足要求的檢測(cè)方法,是評(píng)估純化方法,判斷 蛋白質(zhì)產(chǎn)率、活性、純度的前提。從純度標(biāo)準(zhǔn)要求上看,臨床用 蛋白質(zhì) 其純度一般要求在 98%以上,工業(yè)用途純度要求不高,主要是盡可能出去其他 雜蛋白 。不同的應(yīng)用對(duì) 蛋白質(zhì) 的要求不一樣。 歡迎各位同學(xué)提出寶貴的意見以便進(jìn)一步的修改。課程 老師利用 06 年暑假 和周末 時(shí)間進(jìn)行了大量的預(yù)實(shí)驗(yàn),才使 講義 得以付梓。但是內(nèi)容體系和實(shí)驗(yàn)方法有很大不同 ??紤]到學(xué)生操作的難度 、學(xué)時(shí) 安排 和實(shí)驗(yàn)銜接,設(shè)計(jì)了溶菌酶分離純化綜合 性 實(shí)驗(yàn) 。 內(nèi)容 說(shuō)明 根據(jù) 《 生物工程下 游技術(shù) 》 課程的核心理論內(nèi)容,即目標(biāo)產(chǎn)品的分離、純化。這既是對(duì)他人工作的尊重,也是 自己寫作的依據(jù)。 此外,要記錄同組的實(shí)驗(yàn)成員,并 感謝那些在工作中給予過(guò)幫助的人。討論 部分主要 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,討論結(jié)果的意義和重要性,以及結(jié)果中一些特殊現(xiàn)象的解釋,與其他人的結(jié)果進(jìn)行比較,提出實(shí)驗(yàn)中存在的問(wèn)題以及下一步的計(jì)劃。一般用圖表來(lái)直觀地將實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示出來(lái), 必要的儀器測(cè)試圖譜要 用原件 附在文中,所有的圖表要有清晰的說(shuō)明。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告的寫作過(guò)程是一個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析歸納、去粕取精、去偽存真、把感性認(rèn)識(shí)上升到理性認(rèn)識(shí)的過(guò)程,實(shí)驗(yàn)報(bào)告 除了以上提到的內(nèi)容,還要包括實(shí)驗(yàn)5 結(jié)果 和討論。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告對(duì)于實(shí)驗(yàn)者本人是一個(gè)非常重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的總結(jié),對(duì)于教師是一個(gè)了解學(xué)生實(shí)驗(yàn)完成情況的依據(jù)。進(jìn)行第二次記錄時(shí),要用一種更清晰的方式表示 數(shù)據(jù),如平均值表格或總結(jié)性圖表,要用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然而,這些記錄應(yīng)保留原始記錄的基本特征并更加簡(jiǎn)明。實(shí)驗(yàn)的第 二次記錄本將用于同指導(dǎo)老師討論結(jié)果,并為寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告或?qū)W位論文做準(zhǔn)備。 10. 儀器測(cè)出的原始圖表與記錄粘在一起,不要另外保存。 原始實(shí)驗(yàn)記錄 (實(shí)驗(yàn)報(bào)告) 的內(nèi)容: 1.實(shí)驗(yàn)的標(biāo)題和記錄人員 ; 2. 實(shí)驗(yàn) 的日期、時(shí)間以及地點(diǎn); 3.實(shí)驗(yàn)者預(yù)先設(shè)想的目標(biāo) (實(shí) 驗(yàn)?zāi)康模?: 4.本實(shí)驗(yàn)所用方法: 5. 實(shí)驗(yàn)原理 ; 6.重要儀器的參數(shù)及測(cè)量情況,注意記錄合理的有效數(shù)字; 7.重要外界因素 的記錄 (例如實(shí)驗(yàn)的溫度 、 氣壓 、天氣狀況 ): 8.不常見的或者不熟悉的儀器設(shè)備的描述; 9.有關(guān) 試劑和材料信息 (如名稱,等級(jí) ) 一切非商品材料的來(lái)源; 一切原材料或試劑的提純或試驗(yàn)所用的方法和結(jié)果; 一 切可能影響實(shí)驗(yàn)的偶發(fā)性事件,如停電、接電話中斷實(shí)驗(yàn)等??赡鼙灰粋€(gè)初學(xué)者看成微不足道的細(xì)枝未節(jié),往往是整個(gè)實(shí)驗(yàn)最重要的方面。實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)具有真實(shí) 性、現(xiàn)場(chǎng)性、完 整性和連續(xù)性。雖然教學(xué)實(shí)驗(yàn)課的實(shí)驗(yàn)記錄和提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告與真正進(jìn)行探索性科學(xué)實(shí)驗(yàn)和寫作科研論文有一些明顯的區(qū)別,如前者是在教師指導(dǎo)下按部就班地進(jìn)行,可能出現(xiàn)的復(fù)雜情況、困難程度以及工作量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于真正的科研探索實(shí)驗(yàn),但是從培養(yǎng)訓(xùn)練的角度來(lái)看,它是一種真正科學(xué)實(shí)驗(yàn)的演習(xí),因此 要求學(xué)生 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄和提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)當(dāng) 達(dá)到 探索性科研時(shí)同樣的要求。 對(duì)于實(shí)驗(yàn)安全也必須充分注意, 如易燃、易爆、具化學(xué)毒害性物質(zhì),儀器 損壞及 傷人事故 , 水、電 事故等, 具體細(xì)節(jié)很多,歸納一點(diǎn),走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的一刻就要“提高警惕、保證安全”。實(shí)驗(yàn)課老師的建議是,你在實(shí)驗(yàn)課前準(zhǔn)備越無(wú)分,則越有可能取得實(shí)驗(yàn)成功,且受益越多,你應(yīng)當(dāng)事先預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容,了解實(shí)驗(yàn)的目 的和將要采用的方 法,并將其與理論 課 的學(xué)習(xí)聯(lián)系起來(lái)。 二、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前必須有所準(zhǔn)備 “凡事預(yù)則立,不預(yù)則廢” 。另一個(gè)方面.科學(xué)實(shí)驗(yàn)不是一種個(gè)人的隨意活動(dòng),進(jìn)行科學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)是不依規(guī)矩則不能成方圓的。 其次 ,實(shí)驗(yàn)課上的學(xué)習(xí)內(nèi)容將為你今后的科學(xué)生涯打下寶貴的基礎(chǔ)。有幸參加實(shí)驗(yàn)課的學(xué)生應(yīng)當(dāng)珍惜這種機(jī)會(huì),因?yàn)椴粌H前人長(zhǎng)期的探索提供了所要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的方法,實(shí)驗(yàn)課老師也為實(shí)驗(yàn)課投入了大量時(shí)間進(jìn)行準(zhǔn)備,同時(shí)學(xué)校和老師要為之準(zhǔn)備來(lái)之不易的試劑、儀器和各種實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)驗(yàn)課的目的是教學(xué),使學(xué)生在有限的時(shí)間內(nèi)掌握 一定的實(shí)驗(yàn)方法 。 一 般來(lái)說(shuō) , 學(xué)生實(shí)驗(yàn) 只要遵循正確的操作過(guò)程, 都會(huì)得到明確的結(jié)果。 以下要求主要是針對(duì) 進(jìn)行 《 生物工程下游技術(shù) 》 的實(shí)驗(yàn)教學(xué) 的學(xué)生 編寫的,但是對(duì)其他實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)也有一定的參考意義。實(shí)驗(yàn)對(duì)于 鞏固理論 教學(xué) 中 的基本原理, 培養(yǎng)學(xué)生的獨(dú) 立動(dòng)手能力,提高分析和認(rèn)識(shí)問(wèn)題的能力等具有十分重要的意義。1 《生物工程下游技術(shù)》實(shí)驗(yàn)講義 溶菌酶分離純化綜合 性 實(shí)驗(yàn) 主 編 周林 廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 生物技術(shù)系 2 序 實(shí)踐 是人類獲得知識(shí)的重要途徑。對(duì)于自然科學(xué)來(lái)說(shuō), 實(shí)踐 主要通過(guò) 觀察和實(shí)驗(yàn) 來(lái)進(jìn)行 。 在提倡素質(zhì)教育,提倡創(chuàng)新的現(xiàn)代社會(huì)中,更是如此。 一、珍惜實(shí)驗(yàn)課的機(jī)會(huì) 從根本上說(shuō),實(shí)驗(yàn)課指導(dǎo)老師給學(xué)習(xí)生物 工程下游技術(shù) 的學(xué)生開設(shè)的 綜合性實(shí)驗(yàn)課與真正的科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)有著基本相同的過(guò)程,但是又有 一定 的區(qū)別。這與真正的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中要不斷探索方法而又經(jīng)常出現(xiàn)失敗的情況是不同的。 通過(guò)自己親自動(dòng)手 , 進(jìn) — 步理解實(shí)驗(yàn)背后的 基本 理論,并培養(yǎng)實(shí)事求是和客觀嚴(yán) 謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)實(shí)驗(yàn)素質(zhì),這是任何理論課難于達(dá)到的。在你的學(xué)習(xí)生涯中,能有幸在實(shí)驗(yàn)課堂上親自動(dòng)手實(shí)踐的機(jī)會(huì)能有多少次呢 。實(shí)驗(yàn)課上的內(nèi)容,盡管很多是驗(yàn)證性的,真正探索性的實(shí)驗(yàn)很少,但實(shí)際上仍是前人探索過(guò)程的重復(fù),只要你肯動(dòng)腦筋,你會(huì)從一個(gè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中領(lǐng)會(huì)到前人 為什么這樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、為什么這樣操作、為什么這樣理解和判斷結(jié)果,這與你今后進(jìn)行未知世界探索的科學(xué)實(shí)驗(yàn)從認(rèn)知論上看是基本相同的,因而能培養(yǎng)你科學(xué)的研究思路。前 人為更
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