【正文】 電場(chǎng)作用下 ， 迫使 DNA變形擠過篩孔 ， 而沿著泳動(dòng)方向伸直 ， 因而分子大小對(duì)遷移率影響不大 。 ? 隨后出現(xiàn) RNA印跡 （ 被戲稱為 Northern印跡 ） ， 蛋白質(zhì)印記 （ Western印跡 ） 等 。 電泳結(jié)束后 ， 支持物可以方便地進(jìn)行染色等后續(xù)處理 。 7） 溫度 ? 電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生焦耳熱 ， 使介質(zhì)粘度下降 ， 分子運(yùn)動(dòng)加快 ， 遷移率增加 ， 同時(shí)溫度過高會(huì)使樣品中的生物大分子變性失活 ， 因此電泳時(shí) ， 要控制電壓或電流 ， 也可安裝冷卻散熱裝置 。 6） 電滲 ? 電泳緩沖液相對(duì)于固體支持物的移動(dòng)稱 電滲 。一般最適合的離子強(qiáng)度在 。 因此分離某種蛋白質(zhì)混合液時(shí) ， 應(yīng)選擇合適的 pH使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的差異 。 4） 溶液 pH ? 為使電泳時(shí) pH值恒定 ， 必須采用緩沖液作為電極液 ， 溶液的 pH值決定帶電顆粒的解離程度 ， 亦即決定其所帶電荷的多少 。 其電場(chǎng)強(qiáng)度為 50200V/cm，電泳時(shí)間很短 ， 有時(shí)只需幾分鐘 。 分離時(shí)間較長(zhǎng) ， 從數(shù)小時(shí)到數(shù)十小時(shí) ， 適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì) 。 根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度的不同 ， 電泳可分為： ? 常壓 (100500V)電泳 。 2）膠濃度 3） 電場(chǎng)強(qiáng)度： ? 電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降 ， 也稱電位梯度 (電勢(shì)梯度 )。 常用的支持物有 濾紙 ， 醋酸纖維素薄膜 ， 淀粉凝膠 ， 聚丙烯酰胺凝膠 ，瓊脂糖凝膠等 。酸根取代導(dǎo)致 Agarose帶電。 由于這種方法操作方便 ， 設(shè)備簡(jiǎn)單 ， 需樣品量少 ， 分辨能力高 ，已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn) 方法之一 。 將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合 ， 發(fā)展成免疫電泳技術(shù) ， 能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系 ， 由于建立了超微量技術(shù) ， 。 制成干膜可長(zhǎng)期保存 。 ? 瓊脂糖透明無紫外吸收 ， 電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈監(jiān)測(cè)及定量測(cè)定 。 ? 優(yōu)點(diǎn)如下 ： ? 瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單 ， 電泳速度快 ， 樣品不需事先處理就可進(jìn)行電泳 。 ⑺ 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的 DNA條帶。 ⑸ 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至 35V/cm，可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約 30min60min。 ⑶ 充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加 1 TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠 12mm，小心垂直向上拔出梳子。 （冷卻到 60℃ ，加入100μl的 ，并搖勻。 步驟 ⑴ 1g 瓊脂糖加入 100ml 1 TAE電泳緩沖液中，搖勻。 操作方法 試劑與設(shè)備 上樣 buffer Ⅰ %溴酚藍(lán) ， %二甲苯青 ， 40%蔗糖水溶液 Ⅱ %溴酚藍(lán) ， %二甲苯青 ， 30%甘油水溶液 以上溶液 4℃ 保存?zhèn)溆谩? ? 瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì) ， 不帶電荷 。 ? 以對(duì)于分子量大的樣品 ， 如大分子核酸 ， 病毒等 ， 一般采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離 。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有 電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng) 。該過程可以通過把 分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物 和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳法分離 DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。 為了使試驗(yàn)重復(fù)性好 ， 這些因子都應(yīng)盡可能保持恒定 。 Rf＝ 譜帶遷移距離 / 前沿指示劑遷移距離 ? 測(cè)量遷移率時(shí) ， 應(yīng)以譜帶的中部位置為準(zhǔn) ， 值得注意的是 ，交聯(lián)劑的濃度 ， 交聯(lián)劑和丙烯酰胺的比例 ， 催化劑濃度及聚膠時(shí)的溫度和時(shí)間均對(duì)凝膠柱結(jié)構(gòu)有影響 ， 因而會(huì)影響遷移率 。 ? E — 電場(chǎng)強(qiáng)度 ? q — 顆粒所帶電荷 ? r — 顆粒半徑 ? η — 介質(zhì)黏度 ? 相對(duì)遷移率 （ Rf） ： ? 分離區(qū)帶的泳動(dòng)速度可用相對(duì)遷移率來表示 。η) ? v — 泳動(dòng)度 ? F阻 — 顆粒所受阻力 ? FE — 顆粒所受電場(chǎng)力 ? f — 摩擦系數(shù) ? 由上式可見： 泳動(dòng)度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷以及電場(chǎng)強(qiáng)度有關(guān)。q/(6π ? 電泳時(shí)，帶電顆粒（球形）在介質(zhì)中受力平衡勻速運(yùn)動(dòng)，則有： v = F阻 /f = FE/f = E 這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離 、分析和鑒定的基本原理 。 2022/6/1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 11 2022/6/1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 12 電泳基本原理 ? 電泳是不同的物質(zhì)顆粒在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下 ， 由于所帶電荷及顆粒大小形狀等不同 ， 因此向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的一種方法 。 ? 自由電泳 可分為： ① 顯微電泳 （ 也稱細(xì)胞電泳 ） ， 是在顯微鏡下觀察細(xì)胞或細(xì)菌的電泳行為； ② 移界電泳；③ 柱電泳； ④ 自由流動(dòng)幕電泳； ⑤ 等速電泳等 。 根據(jù)電泳系統(tǒng) pH連續(xù)與否分連續(xù)和不連續(xù) pH電泳 根據(jù)介質(zhì)使用與否分自由和區(qū)帶電泳（濾紙、薄層、凝膠電泳） 根據(jù)電泳槽的形式分有 垂直的 、 水平的 、 柱狀的 、 板狀的 、 毛細(xì)管的 、 濕小室及幕狀的 。 ? 目前 ， 電泳技術(shù)已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)以及與其密切相關(guān)學(xué)科分析中必不可少的手段 。 ? 60年代 ， 找到聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物 ， 在此基礎(chǔ)上發(fā)展了SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 、 等電聚焦電泳 、 雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術(shù) 。 ? 1937年瑞典科學(xué)家 Tiselius建立了 “ 移界電泳法 ” ， 成功地分離血清蛋白質(zhì)各成分 。 第一節(jié) 電泳檢測(cè)技術(shù) 電泳： 帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象。 理解各種蛋白質(zhì)含量測(cè)定技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 生物檢測(cè)技術(shù) 韶關(guān)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 易道生 Office：英東樓 B301 Mp： 13927862492,662492 Email： 內(nèi)容 主要由六個(gè)模塊構(gòu)成： 生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù) 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù) 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 生物檢測(cè)儀器 第一章 生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù) 內(nèi)容 ?第一節(jié)電泳技術(shù) ?第二節(jié)光譜分析技術(shù) ?第三節(jié)生物大分子含量測(cè)定 ?第四節(jié)色譜分析技術(shù) ?第五節(jié)干化學(xué)分析技術(shù) 目標(biāo) 掌握瓊脂糖電泳、 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和操作要點(diǎn)。 掌握可見光和紫外光的分光光度技術(shù)的原理和方法。 理解各種核酸含量測(cè)定技術(shù)的原理和優(yōu)缺點(diǎn)。 1809年由俄國(guó)人發(fā)現(xiàn)。 ? 50年代 ， 改進(jìn)電泳儀 ， 尋找合適的電泳支持介質(zhì) ， 先后找到濾紙 、 醋酸纖維素薄膜 、 淀粉及瓊脂作為支持物 。 這些技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單 ， 操作方便 ， 分辨率高等優(yōu)點(diǎn) 。 電泳槽和大分子分離結(jié)果 電泳技術(shù)分類 從實(shí)際和實(shí)用出發(fā)的分類 根據(jù)分離樣品樣品的數(shù)量和目的分制備和分析電泳 根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)分免疫、層析、等電聚焦、轉(zhuǎn)移、雙向、脈沖梯度電場(chǎng)、垂直交替凝膠電泳等 根據(jù)使用電壓分常壓 （ ＜ 500） 和高壓電泳。 毛細(xì)管電泳是 20世紀(jì) 80年代研制出的一種新型的區(qū)帶電泳方法 ， 具有分辨率好 、 靈敏度高 、 檢測(cè)快捷等特點(diǎn) 。 ? 支持物電泳 根據(jù)支持物的特點(diǎn)又可分為： ? 紙電泳 ? 薄層電泳 ? 醋酸纖維素薄膜電泳 ? 非凝膠性支持物區(qū)帶電泳 (支持物有：淀 粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠等 ) ? 凝膠區(qū)帶電泳：淀粉凝膠電泳、聚丙烯酰 胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳。 ? 在一定 pH條件下 ， 每一種分子都具有特定的電荷 （ 種類和數(shù)量 ） 、 大小和形狀 ， 在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同 ， 各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶 。 ? 帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度稱遷移率或泳動(dòng)度。q/f = Er ? 非球形分子（如線狀 DNA）在電泳過程中受到更大的阻力，即 粒子的泳動(dòng)度與粒子形狀有關(guān) 。 ? 測(cè)定遷移率時(shí) ， 在電泳結(jié)束后要先在指示劑移動(dòng)的位置（ 前沿 ） 作一標(biāo)記 （ 通常是插一根短銅絲 ） ， 染色后 ，量出指示劑移動(dòng)的距離和酶帶移動(dòng)的距離 。 ? 另外 ， 電泳時(shí)電場(chǎng)強(qiáng)度等也會(huì)影響帶電顆粒遷移速度 。 一、瓊脂糖凝膠電泳 原理： 瓊脂糖 是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于 瓊脂糖的濃度 。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。 DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷 ，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。不同 DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。 瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)： ? 天然瓊脂是一種多聚糖 ， 主要由瓊脂糖 (約占 80%)及瓊脂膠組成 。 瓊脂糖是直鏈多糖 ， 它由 D半乳糖和 3,6脫水 L半乳糖的殘基交替排列織成 。 制膠： 稱干粉，融化，倒膠，插梳子，凝固，裝電泳槽。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。） ⑵ 用膠帶將制膠板兩端封好， 插入適當(dāng)梳子 ，將溶解的瓊脂糖（約 50℃ ）倒入，室溫冷卻凝固。 ⑷ 用移液器吸取總 DNA或質(zhì)粒樣品 4μl于封口膜上，再加入 2μl 的 6X載樣緩沖液，混勻后， 小心加入點(diǎn)樣孔 。 ⑹ 將凝膠放入 EB染液中染色 510min,用清水稍微漂洗。 ? 目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳 ， 瓊脂糖是經(jīng)過挑選 ， 以質(zhì)地較純的瓊脂作為原料而制成的 。 ? 瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻 ， 含水量大 (約占 9899%)， 近似自由電泳 ， 樣品擴(kuò)散度較自由電泳小 ， 對(duì)樣品吸附極微 ， 因此電泳圖譜清晰 ， 分辨率高 ， 重復(fù)性好 。 ? 電泳 后區(qū)帶易染色 ， 樣品易洗脫 ， 便于定量測(cè)定 。 ? 目前 ， 常用瓊脂糖作為電泳支持物 ， 分離蛋白質(zhì)和同工酶 。 ? 瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離 、 鑒定核酸 ， 如 DNA鑒定 ， DNA限制性內(nèi)切酶圖譜制作等 。 瓊脂糖濃度 (%) 線型 DNA分子的大小 (Kb) 5～ 60 1～ 20 ～ 10 ～ 7 ～ 6 ～ 3 ～ 2 2022/6/1 韶關(guān)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 25 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳 2022/6/1 26 ? 100 ? 200 ? 300 ? 1,650 ? 1,000 ? 500 ? 850 ? 650 ? 400 ? 5,000 bp ? 2,000 DNA ladder ? DNA ladder ? PCR 產(chǎn)物 1 2 3 4 5 6 7 8 膠孔 ? + + + + 引物二聚體 ? 2022/6/1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 27 影響因素 1）瓊脂糖 來源，純度。 ? 對(duì)支持物的一般要求是均勻 ， 吸附力和電滲小 ， 機(jī)械性能好 ，便于染色或紫外光下檢測(cè) ， 故最好透明 ， 無紫外吸收 。 支持物性質(zhì)不同也會(huì)影響泳動(dòng)速率 ， 如瓊脂于聚丙烯酰胺凝膠都有大小不同的篩孔 ， 在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒的泳動(dòng)速率快 ， 反之則慢 。 電場(chǎng)強(qiáng)度越高 ， 則帶電顆粒泳動(dòng)越快 。 其電場(chǎng)強(qiáng)度為 210V/cm。 ? 高壓 (202210000V)電泳 。 多用于分離氨基酸 、多肽 、 核苷酸 、 糖類等小分子物質(zhì) 。 ? 對(duì)蛋白質(zhì)而言 ， 溶液 pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn) ， 則顆粒所帶的凈電荷越多 ， 泳動(dòng)速度也越快；反之 ， 則越慢 。 2022/6/1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 31 5） ? 緩沖液離子強(qiáng)度越高 ， 則顆粒的電動(dòng)電勢(shì)越小 ， 泳動(dòng)度也越小 。 溶液離子強(qiáng)度 (ionic strength) I=1/2Σcz2 ? 式中 ， I為離子強(qiáng)度 ， c為離子的摩爾濃度 (mol/L)， z為離子價(jià)數(shù) ， 價(jià)數(shù)越高 ， 則離子強(qiáng)度越大 。 如紙電泳時(shí) ， 濾紙吸附 OH離子帶負(fù)電荷 ， 與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負(fù)極移動(dòng) ，會(huì)對(duì)顆粒的移動(dòng)造成不良影 響 ， 故電泳時(shí) ， 電滲 小些為好 。 8） 支持物 ? 現(xiàn)代電泳多在固體支持物上進(jìn)行 ， 使樣品中的不同組分形成不同的區(qū)帶 ， 稱區(qū)帶電泳 。 印跡轉(zhuǎn)移電泳： ? 生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對(duì)電泳分離后的 DNA進(jìn)行分子雜交 ， 但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作 ? 1975年 ， Southern創(chuàng)造了將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后的DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜 (NC膜 )上 ， 再進(jìn)行雜交的方法 ， 被稱為 Southern印跡法 。 交變脈沖電場(chǎng)凝膠電泳 ? 一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于 20kb的 DNA。 ? 如此時(shí)改變電場(chǎng)方向 ， 則 DNA分子必須改變其構(gòu)象 ， 沿新的泳動(dòng)方向伸直 ， 而轉(zhuǎn)