【正文】 標(biāo)記法 DAB＋Ｈ ２ Ｏ ２ 顯色原理 抗生物素 過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)（ avidinbiodinperoxidase plex technique, ABC技術(shù) ） 1． 原理 抗生素 （ avidin又稱卵白素或親和素 ） 是一種糖蛋白 ， 分子量為 68KD， 與生物素有特殊的親和力 （ 親和常數(shù)為 1015M1） ,這種特殊的結(jié)合是不可逆的 ， 同時又不影響彼此的生物活性 。 第一抗體：是細(xì)胞內(nèi)抗原的特異性抗體 標(biāo)記酶的二抗：是一抗的抗體 抗原 間接法 2． 顯色反應(yīng) 免疫組織化學(xué)方法最終的生成物是帶有酶標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物 ， 再依據(jù)酶與底物作用生成不溶性的有色沉淀產(chǎn)物沉積在抗原反應(yīng)的位置 ， 并借此確定該抗原的性質(zhì) 、 存在部位的含量 。 （ 圖 ） 優(yōu)點是一種酶標(biāo)記抗體可以與多種一抗配合檢測 ， 敏感性高于直接法 。 該法簡便 、 特異性強 、 需時短 、 但敏感性低 ， 其缺點是每一種抗原都需要用酶標(biāo)記的特異性抗體 ， 且抗體需要量大 ， 現(xiàn)已不常用 。 4． ABC法： 利用生物素 、 抗生物素間親和特性建立的方法 。 免疫組織化學(xué)包括的內(nèi)容 抗原抗體的制備 抗體標(biāo)記 免疫染色 觀察分析 免疫細(xì)胞化學(xué)的優(yōu)點 靈敏度高 特異性強 定位準(zhǔn)確 應(yīng)用廣泛 組織材料的制備 免疫組織化學(xué)不僅要求保存細(xì)胞 、 組織內(nèi)形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性還需要保存細(xì)胞和組織內(nèi)抗原的免疫性活性 ， 因此在組織材料的制備中有一定的特殊要求 。 封片 免疫組織 （ 細(xì)胞 ） 化學(xué) 免疫組織化學(xué) （ immunohistochemistry） 又稱免疫細(xì)胞化學(xué) （ immunocytochemistry） 是利用特異性抗原抗體反應(yīng)原理 ， 在原位觀察和研究組織細(xì)胞內(nèi) ， 有關(guān)特定的抗原或抗體的存在和分布 ， 并進行定量的技術(shù) 。100%乙醇 I液 7′10′， II液 710′。 6． 反蘭 ： 10′15′（ 流水 ） 。 4． 蘇木精 染 5′。 2． 脫苯 ： 100%乙醇 8′10′。 ⑹ 將組織塊切面朝下 ， 放至紙盒中央 ， 并用鑷子輕微壓一下 ， 然后將標(biāo)簽分別放在蠟塊上 。 ⑷ 點燃酒精燈 ， 準(zhǔn)備無齒尖鑷子 ， 寫好標(biāo)簽； ⑸ 將熔化的包埋蠟傾入金屬包埋框，或紙盒中。 特制的包埋框 紙盒的制作 選蠟原則 夏天用溶點高的蠟（ 6062℃ ） 冬天用稍軟的蠟即可（ 5658℃ ） 包埋：以硬蠟為好。 石蠟分 ： 軟蠟 ， 熔點 4554℃ ， 用于浸蠟； 硬蠟 ， 熔點 5658℃ 或 6062℃ ， 用于包埋 。 故一般在浸入二甲苯前 ， 應(yīng)先經(jīng)二甲苯與酒精混合液 ， 以減少組織的收縮 。 二甲苯： 最常用 ， 易揮發(fā) ， 透明力強 ， 能溶于醇及醚 ， 但不能與水混合 ， 是石蠟的溶劑 。 透明劑是石蠟的溶劑。 一般： 1 1cm體積 50、 70、 80%各 浸泡 68小時； 23mm厚 95%中 浸泡 24小時； 純酒精浸泡 12小時 ； 脫水的時間（ Clearing） 組織透明 組織塊經(jīng)脫水后 ， 需進行石蠟包埋 ， 然后切片 ， 但酒精不能與石蠟混合 ， 需經(jīng)一種乙醇與石蠟之間的媒介物進行透明 ， 即透明劑 。 50% 70% 80% 90% 95% 100% 應(yīng)根據(jù)組織的體積與厚度而定 。 乙醇 丙酮 正丁醇 乙醇： 即可作固定劑，又可作脫水劑，但乙醇與水混合時有較強的物理反應(yīng)，高濃度的酒精對組織有較強的收縮和脆化作用，因此組織不能直接進入純酒精中脫水，應(yīng)由 低 — 高 濃度，逐漸取代組織中的水分，以保證組織脫水徹底，避免組織過渡收縮和硬化。 脫水劑： 即能與水在任何條件下混合 ， 并使組織中的水逐漸出去 ， 由脫水劑取代組織中的水分 ，同時又能與透明劑混合 。 組織固定劑很多： 最常用的有甲醛、乙醇、丙酮、重鉻酸鉀、苦味酸、鋨酸、醋酸。 切開兩端，放血，用鹽水沖洗 （三）、 固定 （ Fixation）和 固定液（ Fixative） 1. 固定的目的和意義 在于保持組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)、構(gòu)造及其組成，使其與生活時原有 形態(tài)和結(jié)構(gòu)相似。 ⑦ 脾臟： 應(yīng)切斷各處靜脈放血，必要時可切開脾臟兩端，用鹽水沖洗，致脾臟呈灰白色。 : ，然后再做扇形切面 . 固定液從動脈注 入，從靜脈流出 縱剖成兩半，再做扇形切面 ⑥ 肺： 因主要觀察肺內(nèi)各級支氣管和肺泡的結(jié)構(gòu)，故不能取邊緣，應(yīng)取肺小葉的中部，一般做橫切面，能看到全貌（肺內(nèi)小支 —— 細(xì)支、終末細(xì)支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡）。 ④ 結(jié)腸 ： 一般取橫結(jié)腸 ， 縱切 ， 洗凈 ， 附貼在濾 紙上 。 組織洗干凈后放在濾紙上鋪開，防止卷縮，而后投入固定液中。如有食物，應(yīng)用生理鹽水清洗干凈，檢查是否有充血、潰瘍。 然后取肝右葉或外左葉中部 ， 作縱切或冠狀切面 。 后胸腔及盆腔內(nèi)器官、組織， 最后取神經(jīng) 。 ?乙醚吸入麻醉法 ?戊巴比妥鈉或烏拉坦注射麻醉法 （ 二）、取材： 1. 動物的選擇： 必須根據(jù)教學(xué)或科研目的和 要求來確定 。 ② 頸椎斷裂殺死動物。細(xì)胞生物學(xué)最常 用的技術(shù) 2022年 7月 1518日北京九華山莊全國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會 組織學(xué)技術(shù) 組織制片技術(shù) 胚胎學(xué)制片技術(shù) 組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 熒光組織化學(xué)及免疫化學(xué)技術(shù) 組織（細(xì)胞）培養(yǎng)技術(shù) 各種顯微鏡技術(shù) 組織學(xué)技術(shù)包括： 組織制片技術(shù) 一、組織制片方法分類：大致分類為 超活體染色制片：又稱體外活體染色。 活體染色制片： 分離制片法： 涂片法 、印片法 、整裝片、 切片法 血管注射法；整體切片法； （一）、動物處死： 直接殺死法： ① 用金屬器械猛擊動物的后腦 部（第四腦室區(qū)）。 ③ 空氣栓塞 組織石蠟標(biāo)本的制作 麻醉致死 ： 麻醉劑應(yīng)以不影響細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)為宜，取材越快越好，否則組織和細(xì)胞成分構(gòu)造均易發(fā)生變性。 ： 取材順序： 先腹腔： 先肝臟、膽囊，其次腎臟、腎上腺， 再取胰腺、脾、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸。 例如 ： ① 肝臟： 大體檢查 ， 又無充血 、 脂肪肝變性 ， 肝硬化 、 寄生蟲 、 腫瘤 。 ② 胃 ：分賁門、胃底、胃體和幽門，胃取材以空的為好。 正常胃粘膜呈灰白色，因 胃腺主要分布在胃體和胃底，故取材時一般取胃底和胃體部，作縱切。 賁門、食道交界處 胃底部 胃體部 幽門部 胃的取材 ：一般作縱切面 ③ 十二指腸 ： 一般取降部和水平部 ， （ 分球部 、 降部和水平部 ） 為了防止肌層收縮時粘膜外翻 、變性 ， 取材中可將固定液注射進十二指腸中 ， 兩端用線結(jié)扎 ， 投入固定液中 46小時后 ， 除去二端的結(jié)扎部位 ， 做橫斷切面 ，再繼續(xù)固定 。 ⑤ 腎臟 ： 由于組織容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)變性 、混濁腫脹和脂變 ， 有時則出現(xiàn)腎小管自溶 ，因此取材和固定是關(guān)鍵 。 可觀察到肺內(nèi)小支、細(xì)支、終末細(xì)支、呼吸性支、肺泡囊、肺泡。一般做橫切面取材。 2. 固定的方法 ： 小塊組織固定、 局部注射固定、 整體注射固定、 蒸氣固定 3． 固定液：分單純固定液和混合固定液。 根據(jù)它們對蛋白質(zhì)的作用又分為 能使蛋白質(zhì)沉淀凝固的： 不能使蛋白質(zhì)沉淀凝固的 ： 乙醇、丙酮、苦味酸、鉻酸 甲醛、重鉻酸鉀、鋨酸、醋酸 中性甲醛 ： 甲醛 （ 37%40%） 100ml 磷酸二氫鉀 4g 磷酸二氫鈉 蒸餾水 900ml 最常用的固定劑 （ 四 ） 、 組織沖洗 、 脫水與透明 組織沖洗：一般必須用水沖洗 其目的 a. 停止固定液繼續(xù)對組織的作用 ； ，以免影響染色； 方 法 簡單沖洗 系列沖洗 水槽沖洗 酒精洗滌 組織脫水： （ Dehydration ） 標(biāo)本經(jīng)過固定和沖洗 ， 組織中含有大量的水分 ， 必須除去組織中的水分 ， 這一過程為脫水 。 種類： 乙醇 、 乙醚 、 正丁醇 、 異丁醇 、 二氧氯環(huán)等 。 脫水方法： 為減少組織的收縮，濃度應(yīng)由低向高過渡。 時間隨組織塊的體積 、 厚度的增大而延長 。 透明劑 可取代組織中的乙醇 使組織透明 ， 組織透明后浸入石蠟中 ， 石蠟可取代組織中的透明劑 ， 浸入組織中 。 透明劑的種類：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏油等。組織在二甲苯中透明的時間不宜過長 ， 否則易于收縮 、 變硬 、 變脆 。 （ 五 ） 、 組織浸蠟與包埋 1. 浸蠟 ：組織經(jīng)脫水 、 透明后 ， 即進入已溶化了的石蠟中 ， 熔化的石蠟透過組織間隙 ， 滲透到組織中 ， 然后包埋成組織蠟塊 。 軟蠟 軟蠟 硬蠟 包埋 1 2 3 軟蠟 4850℃ 軟蠟 5456 ℃ 硬蠟 5660 ℃ ：即組織經(jīng)固定、脫水透明及浸蠟后，使蠟浸入組織達(dá)飽和狀態(tài)，并連同熔化的蠟一塊傾入一個特別的包埋框內(nèi)，冷卻后，便凝固成定形的蠟塊。 石蠟包埋的操作過程： 3 ⑴ 組織浸蠟至第三號蠟中 ⑵ 裝好金屬包埋框 ⑶ 包埋蠟置電爐上溶化，到溫度應(yīng)控制在 65℃ 左右。倒?jié)M即可。 標(biāo)簽 切 片 鋪 片 烤 片 HE染色 1． 脫蠟 ：二甲苯 I液 5′10′， II液 5′10′。 3． 水化 ： 95%乙醇 5′， 80%乙醇 5′。 5． 分化 ：用 1%鹽酸作用 1′。 7． 伊紅 ： 30″60″（ 30秒為好 ） 8． 脫水 ： 80%乙醇一涮 ， 95%乙醇 I液一涮 ， 95%II液一涮 。 9． 二甲苯透明 ： I液中 7′10′， II液中 7′10′。 由于抗原抗體的結(jié)合是高度特異的 ， 因此免疫組織化學(xué)方法具有高度的特異性 、 靈敏性和精確性 。 取材 固定 脫水 浸透 包埋 切片 免疫組化的染色原理與方法 免 疫 組 織 化 學(xué) 染 色 又 稱 免 疫 染 色（ immunostainig） 根據(jù)標(biāo)記的抗體的不同 ，可分為幾種如： （ 一步法 ） ：將標(biāo)記物標(biāo)記在特異性抗體上 （ 一抗 ） ， 便可直接與細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而被顯示； 2． 間接法 （ 二步法 ） ： 將標(biāo)記物標(biāo)記到抗特異性抗體的抗體 （ 二抗 ） 上； 3． 橋連法 （ 多步法 ） ： 用與一抗同種動物產(chǎn)生的 抗標(biāo)記物抗體 與 標(biāo)記物形成免疫復(fù)合物（