生物樣品的預(yù)處理ppt課件-展示頁(yè)
2025-05-10 13:36本頁(yè)面
【正文】 處理； – 高濃度 Na+或 K+離子下，苯酚、氯仿抽提； – 低濃度乙醇沉淀多糖； – 醋酸鉀沉淀多糖。 BioPharm 多糖的干擾及對(duì)策 ? 植物組織往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與 RNA很相似，較難將它們分開(kāi)。 – Northern雜交分析、純化 mRNA以用于體外翻譯或建立 cDNA文庫(kù)、RTPCR及差示分析等過(guò)程中需要高質(zhì)量的 RNA ? 能否有效地去除多糖、酚類(lèi)化合物、萜類(lèi)化合物 RNase和干擾 RNA提取的其它代謝產(chǎn)物是提取高質(zhì)量植物 RNA成敗的關(guān)鍵。為此去除酚類(lèi)化合物或避免反應(yīng)是必須進(jìn)行的步驟。 ? 植物組織被破壞時(shí)，酶和酚類(lèi)處混合接觸狀態(tài)，很易發(fā)生反應(yīng)。 BioPharm 生物樣品特征： ? 目標(biāo)產(chǎn)物濃度普遍較低，懸浮液大部分是 “ 水 ” ，組分復(fù)雜，是含有細(xì)胞、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)、糖類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)等多種物質(zhì)的混合物； ? 分離過(guò)程很容易發(fā)生失活現(xiàn)象， pH、離子強(qiáng)度、溫度等變化常常造成產(chǎn)物的失活； ? 性質(zhì)不穩(wěn)定，易隨時(shí)間變化，如受空氣氧化，微生物污染，蛋白水解作用等。BioPharm 生物樣品的預(yù)處理 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院 BioPharm 初級(jí)分離階段 Primary separation ? Primary separation的任務(wù) – 分離細(xì)胞和培養(yǎng)液 – 破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物 – 溶解包含體 – 復(fù)原蛋白質(zhì) – 濃縮產(chǎn)物 – 去除大部分雜質(zhì) BioPharm 生物樣品的預(yù)處理 ? 不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理 – 植物組織提取物的制備 – 動(dòng)物組織提取物的制備 – 細(xì)菌中重組蛋白的提取制備 ? 細(xì)胞的破碎與分離 – 常見(jiàn)的方法 – 細(xì)胞破碎技術(shù)的發(fā)展方向 BioPharm 1 不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理 ? 樣品來(lái)源：植物、動(dòng)物、微生物，例如：植物或動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液、微生物發(fā)酵液、動(dòng)物血液、乳液和動(dòng)植物組織提取液等。 ? 生物樣品中往往含有大量有機(jī)物、無(wú)機(jī)物及各種微量元素等，因此對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行初步富集和分離，對(duì)干擾組分進(jìn)行初步去除等工作都屬于預(yù)處理。 BioPharm 分離過(guò)程注意點(diǎn) ? 迅速加工，縮短停留時(shí)間 ? 控制好操作溫度和 pH ? 減少和避免與空氣接觸受污染的機(jī)會(huì) ? 總體設(shè)計(jì)好各組分的分離順序 BioPharm 不同來(lái)源樣品分離的預(yù)處理 植物組織中活性物質(zhì)的提取 酶的提取 ? 植物組織中所存在的酚類(lèi)化合物使植物中提取酶的過(guò)程變得復(fù)雜。產(chǎn)物苯醌和單寧酸類(lèi)會(huì)繼續(xù)和酶蛋白反應(yīng) , 使目的酶失去活性。 BioPharm 酚類(lèi)化合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式 可逆結(jié)合 ? 酚類(lèi)化合物的兩個(gè)羥基與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，例如肽鍵的 CO端和 NH端 不可逆結(jié)合 ? 酚類(lèi)化合物的兩個(gè)相鄰羥基被氧化為鄰苯醌之后，通過(guò)共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子中的自由氨基以及巰基結(jié)合 – 引起蛋白質(zhì)活性基團(tuán)集合，引起聚集、交叉結(jié)合和沉淀（酶促褐變作用） BioPharm 預(yù)處理需要注意： ? 溫度盡可能低 ? 提取液的量要保證 “ 充分浸入 ” ? 加入足量酚類(lèi)吸附劑 ? 加入足量氧化酶抑制劑 ? 攪拌轉(zhuǎn)速要恰當(dāng) ? pH要控制在合適范圍，一般 ～ 7 BioPharm 酚類(lèi)吸附劑的種類(lèi)： ? 天然和合成的聚合物 – 清蛋白 – 尼龍粉 – 聚乙烯吡咯烷酮 可溶的（ PVP） – 通過(guò) CON=與酚羥基形成氫鍵 – 聚乙烯聚吡咯烷酮 不溶的（ PVPP） – 聚乙烯和聚丙烯樹(shù)脂，如離子交換樹(shù)
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