生化實(shí)驗(yàn)ppt課件-展示頁(yè)
2025-05-10 13:01本頁(yè)面
【正文】 試劑： 磷酸緩沖液 A（ , ,含 ， EDTA， 5％甘油， 1％的聚乙烯吡咯烷酮） 固體硫酸銨 磷酸緩沖液 B (, ,含 ， EDTA， MgCl2） 粗酶提取 土豆按 1:1（ W/V） 比例與磷酸緩沖液勻漿 2層紗布過濾 濾液以 6000rpm離心 10min 棄除沉淀獲得酶提取液 。質(zhì)粒 DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不完全分離 AC高鹽緩沖液復(fù)性，變性的質(zhì)粒 DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型。 OD260/OD280 ?培養(yǎng)好的菌液 mL， 離心收集菌體 ?600ul 65℃ 預(yù)熱的細(xì)胞裂解液，懸浮菌體 ?加入 60ul 酚滾動(dòng)混勻， 65℃ ， 30min ?加入 600ul氯仿混勻，靜置 4～ 5min，離心 ?取上清 ?等體積氯仿抽提一次 ? 3M NaAc（ ）、 2V乙醇，－ 70℃ 20 min沉淀 DNA ?70％酒精洗滌沉淀 DNA，真空干燥 ?沉淀溶于 40100μL無菌水 質(zhì)粒 DNA提取 細(xì)菌質(zhì)粒的提取 ①細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)：選擇壓力 LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期 ②細(xì)菌的收獲和裂解： 堿變性抽提的原理是利用染色體 DNA與質(zhì)粒 DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。2022 生化實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)安排 1 第一天 粗胰酶提取、卵清蛋白提取 第二天 粗胰酶提取卵清蛋白提取 第三 四天 PPO提取、純化 PPO活性、蛋白濃度測(cè)定 第五 七天 親和層析柱材制備、染色體、質(zhì)粒 DNA提取 酶切、親和層析 酶切、感受態(tài)細(xì)胞制備 連接、感受態(tài)細(xì)胞制備 連接、親和層析 轉(zhuǎn)化、 SDSPAGE、電轉(zhuǎn) Western 胰酶提取 ? 第一天 ? 新鮮豬胰臟 1個(gè) ? 冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織 ? 粉碎胰臟 ? 加 100ml巳預(yù)冷卻的 提取 ? 檢查提取液中 PH，若高于 10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持在 ? 在冷室 5℃ 左右攪拌提取 18— 24h 第 2天 4層紗布過濾，取濾液 (時(shí)間約為 1一 2h) 合并濾液，用乙酸溶液調(diào)正 pH至 放置 3— 5h后，取上清，量其總體積 鹽析：加固體粉狀硫酸銨，至 40％飽和度 鹽析 1hr 12022rpm 離心 10min 上清液加硫酸銨，至 75％飽和度 鹽析 1hr 12022rpm 離心 10min 沉淀 溶于 10ml , MTris 透析過夜， 4 ℃ 保存 卵清蛋白分離提取 ?第一天 ?新鮮雞蛋兩只 ?取蛋清 50 ml ?溫水浴 25℃ ～30℃ ?加入等體積的三氯乙酸－丙酮（ 1:2V/V） ?最終 pH約 ?再繼續(xù)攪拌 30 min ?4℃ 放置過夜 ? 第二天 ? 布氏漏斗抽濾
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