【正文】 小，呈腎形或卵圓形。 【方法】 在載玻片上加鹽水一滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革蘭染色。 初步鑒定試驗(yàn) 革蘭染色 【原理】 淋球菌有特定形態(tài)。 【臨床意義】 淋球菌培養(yǎng)用作診斷和某些特殊目的。所以觀看菌落特征最好在 36h 左右。 5．淋球菌在血平板上培養(yǎng) 24h，雖能見(jiàn)到菌落，但個(gè)兒很小，難以辨認(rèn)其特點(diǎn)。 4．國(guó)內(nèi)目前使用的血液瓊脂或巧克力瓊脂中加人多粘菌素和萬(wàn)古霉素以分別抑制革蘭陰性和革蘭陽(yáng)性雜菌。國(guó)內(nèi)目前使用血液瓊脂加入多粘菌素作抑菌劑效果尚可。另外， 第 6 頁(yè) 共 111 頁(yè) 采樣者應(yīng)熟練掌握前列腺按摩術(shù)，必要時(shí)作前列腺按摩取材。有些人只在陰道口取少量分泌物作分離培養(yǎng)，陽(yáng)性率當(dāng)然會(huì)降低，因?yàn)橛猩盍Φ木鷱膶m頸隨分泌物由陰道流出需一定時(shí)間，陰道內(nèi) pH 值低，又因各種雜菌的作用，到陰道口時(shí)淋菌的生活力較低，再加上培養(yǎng)過(guò)程中各種因素的影響 ，培養(yǎng)成功的機(jī)會(huì)就會(huì)減少。男性尿道前端包括舟狀窩都為復(fù)層鱗狀上皮覆蓋，所以要深人到尿道內(nèi) 2cm~4cm處，并蘸取少量粘膜，陽(yáng)性率才高。 【注意事項(xiàng)】 1．培養(yǎng)要獲得成功，取材是關(guān)鍵之一。若從菌落上取材作涂片，可見(jiàn)到菌的大小及染色的深度有差異，排列也不一致，約有 25%的菌為典型的雙球菌，其他 75%為單球菌、四聯(lián)形或八疊形。用白金耳觸之有粘性。 【結(jié)果】 淋球菌在血平皿上經(jīng) 24h~48h 的培養(yǎng)后，可形成圓形、凸起、濕潤(rùn)、光滑、半透明或灰白色菌落。淋球菌為需氧菌，但最初從人體分離 時(shí)，為促進(jìn)生長(zhǎng)，需用 5%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)。培養(yǎng)的最適溫度為 35℃ ~36℃ ，超過(guò) ℃ 或低于 30℃ 便生長(zhǎng)不良。取材處離實(shí)驗(yàn)室距離較遠(yuǎn)時(shí)，應(yīng)將標(biāo)本接種于 Smart 或 Amies 運(yùn)送培養(yǎng)基或 1%葡萄糖肉浸液中，并注意在運(yùn)送過(guò)程中保溫。 第 5 頁(yè) 共 111 頁(yè) 3．培養(yǎng)條件 淋球菌對(duì)外環(huán)境變化頗為敏感，對(duì)寒冷和干燥抵抗力很弱。 TM 培養(yǎng)基是在 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入血紅蛋白 (1%)、抗生素 (萬(wàn)古霉素 3181。培養(yǎng)基的 pH 值以 為好。所用血液如羊血、兔血和人血均可，濃度為 8%~10%。g /ml)和萬(wàn)古霉素 ( 181。目前國(guó)內(nèi)常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為了提高陽(yáng)性率，可同時(shí)取二份標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。從直腸取材時(shí)，應(yīng)將棉拭插入肛門(mén) ，如果棉拭碰到糞便，應(yīng)換一個(gè)棉拭重取。從女病人的 宮頸取材時(shí)，應(yīng)先用溫水濕潤(rùn)擴(kuò)陰器 (不要用液體石蠟等潤(rùn)滑油 )。 【方法】 1．取材 培養(yǎng)要獲得成功，取材的部位和方法要準(zhǔn)確。各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成的菌落形態(tài)各不相同。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦用涂片法來(lái)檢查女性病人。例如，從男性尿道取材特異性高，而從女性宮頸取材特異性低。 【臨床意義】 涂片檢查方法簡(jiǎn)便、有效、價(jià)格低廉且有一定的敏感性和特異性。當(dāng)把加熱的涂片放到手背上時(shí)應(yīng)不感到太燙。在大量染片時(shí)，最好用一已知的革蘭陽(yáng)性菌 (如葡萄球菌 )和陰性菌 (如大腸桿菌 )作對(duì)照。涂片過(guò)厚，加之染色過(guò)程中脫色時(shí)間不足，革蘭陰性菌也會(huì)呈現(xiàn)紫色。涂擦過(guò)勁，細(xì)胞破裂或變形，菌從細(xì)胞內(nèi)逸出，會(huì)造成診斷上的混淆。對(duì)有些菌有時(shí)難以下結(jié)論，需進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。 多數(shù)多形核細(xì)胞中并不含淋菌，但不少膿細(xì)胞中常含有 一 至數(shù)對(duì)，甚至 20對(duì) 30 對(duì)淋球菌，淋球菌常存在于細(xì)胞漿內(nèi)。菌體長(zhǎng)約 ，寬約 。在有些細(xì)胞中吞噬有淋球菌。 晾干后油鏡鏡檢。 乙醇丙酮脫色 1min 左右。 2．涂片后，待自然干燥后火焰固定， 革蘭氏染色：結(jié)晶紫染色 1min。待自然干燥后加熱固定，染色，鏡檢。因此，取病人尿道分泌物制成涂片后做革蘭染色，檢查有無(wú)典型細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，可作初步診斷的依據(jù)。在有些膿細(xì)胞內(nèi)可有許多淋球菌。如需時(shí)再應(yīng)使用生長(zhǎng)運(yùn)送培養(yǎng)基，但即便如此，也不應(yīng)超過(guò) 2 天。如取材本處離實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)時(shí)，可將標(biāo)本置于無(wú)營(yíng)養(yǎng)性的 Stuart 或 Amies運(yùn)送培養(yǎng)基或選擇性生長(zhǎng)培養(yǎng)墓如 Trmlsgrow 中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。因此，為了保證培養(yǎng)成功，應(yīng)盡量縮短標(biāo)本離體時(shí)間。檢查淋菌性咽炎時(shí)從扁桃體或扁桃體窩或咽后壁取材。從女病人的宮頸取材時(shí)，應(yīng)將棉拭插入宮頸口 ，稍轉(zhuǎn)動(dòng)并停留 10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。待自然干燥后作染色。標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后，菌落形態(tài)典型、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，菌體為革蘭陰性雙球菌，則初步診斷為陽(yáng)性培養(yǎng)物，如有某些性狀不符合，則可進(jìn)一步用糖發(fā)酵試驗(yàn)及直接免疫熒光法等作鑒定加以確診。淋球菌感染的女病人，常僅 有膿性宮頸分泌物或無(wú)癥狀。 淋球菌感染男性病人，常會(huì)出現(xiàn)尿痛和尿道流膿等臨床癥狀。在感染淋球菌后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的潛伏期 (平均 3 天 ~5 天 )。繼而侵入細(xì)胞內(nèi)增殖，使粘膜上皮破壞，形成炎癥，出現(xiàn)一系列癥狀 。但另一方面，也有 5%20%的男性和 60%的女性病人呈現(xiàn)無(wú)癥狀經(jīng)過(guò)。 第 1 頁(yè) 共 111 頁(yè) 第一章 淋病的實(shí)驗(yàn) 淋病 (gonorrhea)是指由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖道的化膿性感染，如尿道炎、宮頸炎和直腸炎等。如不及時(shí)治療，淋球菌可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起附睪、前列腺、輸卵管及盆腔等器官的炎癥，甚至可經(jīng)血液傳播到全身其他部位，形成淋菌性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等合并癥。淋球菌好侵犯人類(lèi)泌尿生殖道的柱狀上皮細(xì)胞，憑借特異的結(jié)構(gòu)和粘膜表面與之相匹配的部位粘附。 一、淋病診斷步驟 人類(lèi)尿道上皮尤其是柱狀上皮細(xì)胞對(duì)淋球菌相當(dāng)敏感。由于細(xì)菌和毒素的作用，粘膜壞死、脫落、神經(jīng)末梢暴露、炎癥浸潤(rùn)、組織液滲出，病人會(huì)出現(xiàn)尿急、尿痛和尿道流膿等急性尿道炎癥狀。這時(shí)取尿道分泌物作涂片，經(jīng)革蘭染色后，如見(jiàn)到有符合淋球菌形態(tài)特征的革蘭陰性細(xì)胞內(nèi)雙球菌，則初步診斷陽(yáng)性，可對(duì)病人進(jìn)行治療；如涂片查菌陰性，應(yīng)從尿道取標(biāo)本進(jìn)行淋球菌培養(yǎng)。對(duì)女病人不推薦用涂片法檢查，而主張直接從宮頸取材進(jìn)行培養(yǎng)。 二、標(biāo)本的采集和運(yùn)送 在取材作涂片時(shí)，應(yīng)先用滅菌等滲鹽水洗凈尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，用棉拭或白金耳蘸取膿液后輕輕涂布于載玻片上。 第 2 頁(yè) 共 111 頁(yè) 如由男性病人前尿道取材作培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)用白金耳或藻酸鈣拭子深入尿道2cm~4cm，取出的分泌物應(yīng) 略帶粘膜。從肛門(mén)取材時(shí)，應(yīng)將棉拭插入肛門(mén) ，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中取材。 淋球菌對(duì)外環(huán)境因素如干燥抵抗力很弱。在醫(yī)院門(mén)診部，從病人取材后，應(yīng)立即接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。 標(biāo)本在無(wú)營(yíng)養(yǎng)運(yùn)送培養(yǎng)中 (在室溫 25℃ 條件下 )， 12h 對(duì)分離率無(wú)影響，在 24h 內(nèi)分離大于 90%。 淋病的涂片檢查 【 原理 】 急性淋菌性尿道炎病人常有大量黃色膿性分泌物。淋球菌革蘭染色呈陰性反應(yīng)，具有特殊的菌體形態(tài)。 【方法】 1．先用滅菌等滲鹽水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，蘸取膿液后輕輕涂布于載玻 片上。常用革蘭染色，也可用美藍(lán)染色。 碘媒染液染色 1min。 第 3 頁(yè) 共 111 頁(yè) 石炭酸復(fù)紅復(fù)染 1min。 【結(jié)果】 在急性病人的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，?？梢?jiàn)到大量紅色多形核白細(xì)胞。淋球菌為革蘭陰性，呈卵圓形或圓形，常成對(duì)排列，接觸面扁平或稍凹。但兩菌大小可有差異。 在病期較長(zhǎng)的淋病病人的涂片中淋球菌比較少，有時(shí)呈單個(gè)、四聯(lián)和八疊狀，位于細(xì)胞外。 【注意事項(xiàng)】 1．涂片時(shí)不要用力涂擦，而應(yīng)將棉拭在玻片上輕輕滾動(dòng)，因急性病人診斷標(biāo)準(zhǔn)為見(jiàn)到“細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌”。 2．涂片厚薄要合適。因此，脫色 時(shí)間要視涂片厚薄而定。 3．固定涂片，只要將涂片迅速通過(guò)火焰 2~3 次，避免加熱過(guò)度使細(xì)胞變形扭曲。 4．不推薦用涂片檢查來(lái)診斷淋菌性直腸和咽部的感染，也不推薦用作判愈。但其特異性隨著取材部位的不同而有所不同。因女性宮頸分泌物中雜菌很多，有的在形態(tài)上很像 淋球菌。 第 4 頁(yè) 共 111 頁(yè) 淋球菌的分離培養(yǎng) 【原理】 如果標(biāo)本中有淋球菌，則在合適的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后可長(zhǎng)成菌落。根據(jù)菌落的大小、表面高起或扁平、光澤、色素和邊緣的情況等，作為細(xì)菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。由男性病人前尿道取材時(shí)，應(yīng)該用細(xì)小棉拭子或藻酸鈣拭子或白金耳伸入尿道口 2cm~4cm，取出的分泌物應(yīng)略帶粘膜。應(yīng)將棉拭插入宮頸口 ，稍轉(zhuǎn)動(dòng)并停留 10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。檢查淋菌性咽炎時(shí)，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。 2．培養(yǎng)基 由于淋球菌的營(yíng)養(yǎng)要求較復(fù)雜，所用的培養(yǎng)基中應(yīng)含有動(dòng)物蛋白及細(xì)菌生長(zhǎng)所需的各種因子。為抑制雜菌，在培養(yǎng)基中可加入少量抗菌物質(zhì)如多粘菌素 B(25181。g /ml)等。但避免血液中加入抗凝劑等藥物。目前國(guó)外常用的培養(yǎng)基有 ThayerMartin(TM)培養(yǎng)基、 NewYork City(NYC)培養(yǎng)基和 MartinLewis(ML)培養(yǎng)基等。g /ml、粘菌素 /ml 和制霉菌素 /ml)和淋球菌增菌劑，使絕大多數(shù)雜菌被抑制而淋球菌菌落長(zhǎng)得較大，在乎皿中幾 乎呈純培養(yǎng)，從而大大提高了由子宮頸、尿道，尤其是咽和直腸部位分離出淋菌的陽(yáng)性率。因此，為了保證培養(yǎng)有足夠的成功率，取材后應(yīng)立即接種，標(biāo)本離體時(shí)間越短越好。接種的血平皿應(yīng)先放在 37℃ 溫箱中預(yù)溫。因此，孵育的溫度要恒定。為保持一定的濕度，可在培養(yǎng)缸中放些浸水棉球。邊緣呈花瓣?duì)睿睆綖? ~。如繼續(xù)培養(yǎng)，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現(xiàn)皺縮。 淋球菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)于液體表面，或稍有輕度混濁和顆粒沉淀。取材的深度一定要夠，因?yàn)榱芮蚓冒l(fā)于柱狀上皮細(xì)胞而不是復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞。女性病人取材時(shí)，要求將棉拭插入宮頸管，轉(zhuǎn)動(dòng)并停留 10s~30s 也是這個(gè)道理。 2．對(duì)癥狀不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后 2~3h 之后。 3．對(duì)女性淋病的檢查主張用淋球菌培養(yǎng)。但蛋白胨最好用進(jìn)口的 (Oxoid 公司產(chǎn)品或日本產(chǎn)或Polypepton 等 )，并用肉浸液加酵母浸膏等為好。但由于部分淋球菌 (某些地區(qū)可高達(dá) 5%)對(duì)萬(wàn)古霉素也敏感，因此， 最好不用萬(wàn)古霉素。24h~36h，菌落迅速長(zhǎng)大。超過(guò) 36h，菌落特征也會(huì)有較大的改變。培養(yǎng)法對(duì)男性及女性標(biāo)本都是適用的，是世界衛(wèi)生組織推薦的篩查淋病病人的唯一方法，也是診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn)方法。挑取可疑菌落在玻片上制成鹽水涂片，經(jīng)革蘭染 色，若見(jiàn)到具淋菌特征形態(tài)的雙球菌，可作出初步診斷。 【結(jié)果】 可見(jiàn)革蘭陰性球菌。約 1/4為雙球菌，多數(shù)為單球菌，個(gè)別呈四聯(lián)或八疊狀。 第 7 頁(yè) 共 111 頁(yè) 【注意事項(xiàng)】 1． 涂片厚薄要均勻，革蘭氏染色正確，必要時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照。 【臨床意義】 典型革蘭氏陰性雙球菌表明可能為淋球菌，但必須進(jìn)一步做試驗(yàn)鑒 定。往培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了 24h~48h 的菌落上加氧化酶試劑 (%~1%新配制的鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液 )，淋球菌菌落的顏色可變成紫紅乃至黑色。 2．也可先挑取可疑菌落涂于干濾紙條上，滴加試劑，涂菌處變成紅色者為陽(yáng)性。 【結(jié)果】 淋球菌氧化酶陽(yáng)性，但氧化酶陽(yáng)性者并不一定是 淋球菌。正常的氧化酶試劑 (鹽酸二甲基對(duì)苯二胺或鹽酸四甲基對(duì)苯二胺 )應(yīng)為談紅色。試劑溶液配好后應(yīng)放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用一周。 第 8 頁(yè) 共 111 頁(yè) 3．鹽酸四甲基對(duì)苯二胺比鹽酸二甲基對(duì)苯二胺敏感，將一滴鹽酸叫甲基對(duì)苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快變?yōu)?深紫色并保留半 分鐘 以上則為陽(yáng)性。 4．如需保留 菌 種，在菌落末完全變黑時(shí)可挑少許轉(zhuǎn)種。 【臨床意義】 氧化酶試驗(yàn)試劑易得、操作簡(jiǎn)便，是淋球菌重要的初步診斷試驗(yàn)之一。如某些性狀不符，則應(yīng)進(jìn)一步作確診試驗(yàn)。 【方法】 世界衛(wèi)生組織推薦的快速非生長(zhǎng)的糖發(fā)酵微量法操作如下： 1．用無(wú)選擇性的巧克力或哥倫比亞瓊脂平皿 (含 5%馬血或羊血 )轉(zhuǎn)種受檢菌株，以獲得純菌。每升 BSS 中含磷酸氫二鉀 ，磷酸二氫鉀 ，氯化鉀 8g，酚紅 ， pH 值為 ~。 2．用 5 支 70mm 10mm 小試管，在 1 管 ~4 管中分別加入 20%經(jīng)過(guò)濾滅菌的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖溶液各 。 3．每管加 。在 37℃ 水浴箱中孵育 4h，觀察結(jié)果。因此，只有葡萄糖管的 pH 值下降，顏色由紅變黃。 幾種奈瑟菌的糖發(fā)酵反應(yīng)情況 葡萄糖 麥芽糖 蔗 糖 乳 糖 淋