【正文】 3’的 DNA 聚合酶活性； 5’→ 3’的核酸外切酶活性； 3’→5’的核酸外切酶活性 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 大片段（ Klenow ）基本用途：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 5’粘性末端； DNA 片段的同位素末端標(biāo)記 ； cDNA 第二鏈的合成； 雙脫氧末端終止法測(cè)定 DNA 序列 2） T4DNA 聚合酶 T4DNA 聚合酶的基本特性： 5’→ 3’的 DNA 聚合酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性；在無(wú) dNTP 時(shí)，可以從任何 3’ OH 端外切；在只有一種 dNTP 時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止；在四種 dNTP 均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位 T4DNA 聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的 3’粘性末端，該酶也能降解雙鏈 DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多 3） T7 噬菌體 DNA 聚合酶 基本特性： 5’→ 3’的 DNA 聚合酶活性和 3’→ 5’的核酸外切酶活性；已知 DNA聚合酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)；改造后成為雙脫氧終止法對(duì)長(zhǎng)片段 DNA 的測(cè)序酶 基本用途：用于拷貝長(zhǎng)段模板的引物延伸反應(yīng)；通過(guò)補(bǔ)平或交換（置換）反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記；給載體或目的 DNA 加上互補(bǔ)的同聚物尾； DNA 片段 3’末端的同位素標(biāo)記 4）依賴于 RNA 的 DNA 聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶） 基本特性：以 RNA 為模板聚合 cDNA 鏈；雙向外切 DNARNA 雜合鏈中的 RNA 鏈 基本用途：將真核基因的 mRNA 轉(zhuǎn)錄成 cDNA，構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)；對(duì)具有 5‘突出端的 DNA 片段的 3’端進(jìn)行補(bǔ)平和標(biāo)記、制備探針；代替 Klenow 片段，用于 DNA 序列測(cè)定 5）耐熱 DNA 聚合酶（ Taq 酶） Taq 酶的特點(diǎn)：熱穩(wěn)定性；離子依耐性； 忠實(shí)性： 5’ 3’聚合酶活性和 5’3’外切酶活性 8 平末端 DNA 片段的連接方法包括哪幾種？ 4 種： （ 1）直接用 T4 DNA 連接酶連接； （ 2）先用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶，給平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴之后再用 DNA 連接酶進(jìn)行連接； （ 3）用銜接物連接平末端 DNA 分子；（ 4） DNA 接頭連接法。 4） 核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì) 5） 酶切消化反應(yīng)的溫度 大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是 37℃ 7. DNA 聚合酶作用的特點(diǎn)是什么？簡(jiǎn)述幾種重要的 DNA 聚合酶及其基本用途。 6 限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)有哪些？影響其活性的因素有包括哪些方面？ 特點(diǎn)： 1） 識(shí)別位點(diǎn)的 DNA 序列具有回文結(jié)構(gòu)； 2） 切割 DNA 均產(chǎn)生含 5’磷酸和 3’羥基的末端； 3） 錯(cuò)位切割產(chǎn)生粘端，沿對(duì)稱軸切割產(chǎn)生平末端； 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 ： 1） DNA 樣品的純度：加大酶的用量， 1 mg DNA 用 10U 酶； 加大反應(yīng)總體積 ； 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 2） DNA 樣品的甲 基化程度：識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化會(huì)強(qiáng)烈抑制限制酶的活性 ， 因此在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌株 3） DNA 的分子結(jié)構(gòu) 某些限制性核酸內(nèi)切酶切割超螺旋的質(zhì)粒 DNA 或病毒 DNA 所需要的酶量，要比消化線性 DNA 的高出許多倍。 同尾酶 ：來(lái)源不同，識(shí)別的靶序列也各不相同，但能產(chǎn)生相同的粘性 末端，稱為同尾酶。 5 解釋同裂酶、同尾酶 同裂酶（同切酶或異源同工酶） ： 有些來(lái)源不同的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 位點(diǎn)偏愛(ài) ： 某些限制性內(nèi)切 酶對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是 4 個(gè)或 6 個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別 5 個(gè)核苷酸 4 什么是回文結(jié)構(gòu)、粘性末端、平末端、位點(diǎn)偏愛(ài)、星號(hào)活性？ 回文結(jié)構(gòu)：序列正讀和反讀是一樣的，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方向讀序列是完全一樣的。 第二類 (II 型 )限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切 割雙鏈。 第三類（ III 型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。 3 核酸酶包括哪幾類？簡(jiǎn)述限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其特點(diǎn)？ 核酸酶的分類： 1）根據(jù)核酸底物分 RNA 酶、 DNA 酶和底物非專一性核酸酶； 2）根據(jù)作用方式分內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶； 3) 根據(jù)對(duì)底物堿基專一性分堿基專一性核酸酶（切割部位的堿 基序列高度專一性）和非堿基專一性核酸酶（切割部位的堿基序列隨機(jī)性） 按限制酶的亞基組成和切斷核酸情況的不同，Ⅰ型 、 Ⅱ型 和 Ⅲ型 第一類（ I 型）限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割 DNA 鏈，其切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。 1) 分離純化過(guò)程 破碎細(xì)胞 + DNA 抽提液 (EDTA、去污劑、還原劑 ) 65℃溫育 20min 冰浴冷卻 離心去細(xì)胞碎片 苯酚抽提法（方法①）、 CsCl 密度梯度離心（方法②） 2） 兩種方法比較：上述兩種分離方法都包含了下述四個(gè)分離步驟 可溶與不可溶物分離：高速離心除去細(xì)胞碎片，保留上清液；使蛋白質(zhì)分離：苯酚抽提或超速離心 ； 使 RNA分離： RNase 處理或超速離心；使 DNA 與其它可溶物分離 CsCl 法操作步驟少，分離 DNA 分子量大，但耗財(cái)多，且需超速離心機(jī)。 基因工程思考題 1 什么是基因工程？基因工程操作的基本技術(shù)路線是什么？ 基因工程：按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外 DNA 重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完整，創(chuàng)造出符合人們需要的新的生物類型 ，或者利用這種技術(shù)對(duì)人類疾病進(jìn)行基因治療。 聯(lián)系：現(xiàn)代生物技術(shù)的研究是以傳統(tǒng)生物技術(shù)為基礎(chǔ)。 采用基因工程技術(shù)，對(duì)這些菌株進(jìn)行改造，可以提高微生物酶的降解活性，成為治理污染的超級(jí)?工程菌?。 生物技術(shù)在環(huán)保方面的應(yīng)用： （ 1）污染監(jiān)測(cè) 現(xiàn)代生物技術(shù)建立了一類新的快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)環(huán)境的有效方法，主要包括利用新的指示生物、利用核酸探針和利用生物傳感器。 （ 2） 疾病診斷 如 單克隆抗體診斷試劑和 DNA 診斷技術(shù)的應(yīng)用，使許多疾病特別是腫瘤、傳染病在早期就能得到準(zhǔn)確診斷。 生物技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用： 目前，醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域是現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用得最廣泛、成績(jī)最顯著、發(fā)展最迅速、潛力也最大的一個(gè)領(lǐng)域，生物技術(shù)貫穿了疾病預(yù)防、診斷和治療的整個(gè)過(guò)程。凝血酶原Ⅲ用于治療血友病 ?？茖W(xué)家已經(jīng)培育出多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它們的乳腺能特異性地表達(dá)外源目的基因，因此從它們產(chǎn)的奶中能獲得所需的蛋白質(zhì)藥物，這種生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的方式叫做乳腺生物反應(yīng)器。專家們認(rèn)為，香蕉可能是最適合于生產(chǎn)疫苗的植物，因?yàn)橄憬兑子诮邮軐?dǎo)入的外源目的基因，又是最普通和受歡迎的水果。 （ 3） 農(nóng)業(yè)新領(lǐng)域 傳統(tǒng)意義上的農(nóng)業(yè)是向我們提供食物和工業(yè)原料，而基因工程不僅提高了農(nóng)牧產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且一些轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物有了遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出僅供食用的價(jià)值 —— 生產(chǎn)藥物。 （ 2） 畜禽生產(chǎn) 首先，生物技術(shù)不僅能加快畜禽的繁殖和生長(zhǎng)速度，而且能改良畜禽的品質(zhì)，提供優(yōu)質(zhì)的肉、奶、蛋產(chǎn)品。其次，生物技術(shù)還能改良作物品質(zhì)。其次，生物技術(shù)為新能源的利用開(kāi)辟了道路。第三，利用生物技術(shù)可開(kāi)發(fā)出新的材料類型。 生物技術(shù)在材料方面的應(yīng)用： 首先，生物技術(shù)使一些廢棄的生物材料變廢為寶。其次，生物技術(shù)可以提高食品質(zhì)量。 現(xiàn)代生物技術(shù) :基因工程 ,細(xì)胞工程 ,酶工程 ,發(fā)酵工 程 ,蛋白質(zhì)工程 ,抗體工程 ,組織工程 ,生物芯片 生物技術(shù)對(duì)人類產(chǎn)生什么樣的影響？ 1） 改善農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，解決食品短缺 2） 提高生命質(zhì)量，延長(zhǎng)人類壽 命 3） 解決能源危機(jī)，治理環(huán)境污染 4） 制造工業(yè)原料，生產(chǎn)貴重金屬 5） 生物技術(shù)的安全及其對(duì)倫理、道德、法律的影響 （如轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全問(wèn)題、轉(zhuǎn)基因生物與食物安全、 為什么說(shuō)生物技術(shù)是一門綜合性學(xué)科？它與其他學(xué)科有什么關(guān)系 ？（大題） 生物技術(shù) 至少包括基因工程 ,細(xì)胞工程 ,酶工程 ,發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程等五項(xiàng)工程 .這五項(xiàng)工程互相聯(lián)系 ,互相滲透 ,其中以基因工程為核心 . 現(xiàn)代生物技術(shù)是以 20 世紀(jì) 70 年代 DNA 重組技術(shù)的建立為標(biāo)志的 ， 是一門集生物學(xué) ,醫(yī)學(xué) ,工程學(xué) ,數(shù)學(xué) ,計(jì)算機(jī)科學(xué) ,電子學(xué)等多學(xué)科互相滲 透的綜合性學(xué)科 . 生物技術(shù)的應(yīng)用包括那些領(lǐng)域？ 現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛 ,它對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生了巨大的影響 .其應(yīng)用領(lǐng)域包括農(nóng)業(yè) ,工業(yè) ,醫(yī)學(xué) ,藥物學(xué) ,能源 ,環(huán)保 ,冶金 ,化工原料等 .這些領(lǐng)域的應(yīng)用又必然對(duì)人類社會(huì)的政治 ,經(jīng)濟(jì) ,軍事等方面帶來(lái)影響 . 現(xiàn)代生物技術(shù)是一把雙刃劍 .它在給人類帶來(lái)種種好處的同時(shí) ,也可能給人類帶來(lái)安全隱患以及對(duì)人類社會(huì)的倫理 ,道德 ,法律等方面帶來(lái)沖擊 . (伴隨著生命科學(xué)的新突破，現(xiàn)代生物技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等眾多領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。第一章 生物技術(shù)概論思考題 什么是生物技術(shù)？它包括那些內(nèi)容？ 生物技術(shù)（ 生物工程），是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，采用先進(jìn)的工程技術(shù)手段，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或者加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。 生物技術(shù) 的內(nèi)容： 傳統(tǒng)生物技術(shù) ， 指舊有的傳統(tǒng)的釀造業(yè)和食品加工 。 ) 生物技術(shù)在工業(yè)方面的應(yīng)用： （ 1）食品方面 首先，生物技術(shù)被用來(lái)提高生產(chǎn)效率，從而提高食品產(chǎn)量。第三，生物技術(shù)還用于開(kāi)拓食品種類。其次，生物技術(shù)為大規(guī)模生產(chǎn)一些稀缺生物材料提供了可能。 生物技術(shù)在能源方面的應(yīng)用： 首先，生物技術(shù)提高了石油開(kāi)采的效率。 生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用： (1)農(nóng)作物和花卉生產(chǎn) 首先，生物技術(shù)既 能提高作物產(chǎn)量，還能快速繁殖花卉。第三，生物技術(shù)在培育抗逆作物中發(fā)揮了重要作用。其次，生物技術(shù)可以培育抗病的畜禽品種，減少飼養(yǎng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)。 ，如 在轉(zhuǎn)基 因煙草中表達(dá)出了乙型肝炎疫苗，轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、番茄等也都已用來(lái)進(jìn)行生產(chǎn)疫苗的研究。 。目前已培育成功含α 1抗胰蛋白酶（ AAT）的轉(zhuǎn)基因羊， ATT 用于治療囊性纖維化和肺氣腫。促紅細(xì)胞生成素（ EPO）能促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，對(duì)腫瘤化療以及腎臟機(jī)能下降引起的紅細(xì)胞減少具有積極的治療作用。 （ 1） 疾病預(yù)防 如 利用基因工程技術(shù)來(lái)生產(chǎn)疫苗。 （ 3） 疾病治療 生物技術(shù)在疾病治療方面主要包括提供藥物、基因治療和器官移植 等方面。（ 2）污染治理 現(xiàn)代生物治理多采用純培養(yǎng)的微生物菌株 。 ,它具有高技術(shù)的 六高 特征是指哪 六高 ？ ?六高?特征是 高效性 、 高智力 、 高投入 、 高競(jìng)爭(zhēng) 、 高風(fēng)險(xiǎn) 、 高勢(shì)能 （高勢(shì)能指 對(duì)國(guó)家的政治，經(jīng)濟(jì)、文化和社會(huì) 發(fā)展具有很大的影響，具有很強(qiáng)的滲透性和擴(kuò)散性 . 1） 前生物工程（經(jīng)驗(yàn)生物工程）時(shí)期：從公元前 7000 年 1593 年（明朝末年） 2） 古典生物工程時(shí)期：荷蘭人發(fā)明顯微鏡 3） 實(shí)驗(yàn)生物工程時(shí)期 ： 1953 年發(fā)現(xiàn) DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu) ； 19611966 破譯遺傳密碼 ； 1970 分離出第一個(gè)Ⅱ類限制性內(nèi)切酶 ； 1972 DNA 體外重組技術(shù)建立 ； 1975 建立雜交瘤技 ； 1976 DNA 測(cè)序技術(shù)誕生 ； 1978 第一次生產(chǎn)出基因工程胰島素 ； .........1986 第一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物獲批準(zhǔn)田間試驗(yàn) 和 第一個(gè) DNA 重組人體疫苗 (乙肝疫苗 )研制成功 ； 1988 PCR 技術(shù)問(wèn)世 ； 1989 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花獲批準(zhǔn)田間試驗(yàn) ； 1990 美國(guó)批準(zhǔn)第一個(gè)體細(xì)胞基因治療試驗(yàn) ； 1990 人類基因組計(jì)劃正式啟動(dòng) 、 第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 (鮭魚 )獲批準(zhǔn)養(yǎng)殖 ； 1997 英國(guó)培養(yǎng)出第一只克隆羊?多莉? ； 1998 人體胚胎干細(xì)胞系建立 ； 2020 人類基因組工作框架圖完成 ； 2020 重要糧食作物 —— 水稻基因圖在中國(guó)完成 ； 2020 人類基因組測(cè)序工作完成 區(qū)別：傳統(tǒng)生物 技術(shù)的研究水平是細(xì)胞或組織水平，現(xiàn)代生物技術(shù)的研究水平是在分子水平?，F(xiàn)代生物技術(shù)的研究能夠促進(jìn)傳統(tǒng)生物技術(shù)研究。 2 簡(jiǎn)述供體 DNA 分離過(guò)程和方法， 并且比較這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。苯酚法耗時(shí)少，不需昂貴儀器，但操作步驟多，易使 DNA 分子斷裂。這類酶如 Eco B、 Eco K 等。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)也不是特異性的。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。 粘性末端： 兩條鏈上的斷裂位置是交錯(cuò)和對(duì)稱圍繞著一個(gè)對(duì)稱軸排列，這種形式的斷裂結(jié)果形成具有粘末端的 DNA 片段； 平末端： 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個(gè)對(duì)稱軸的中心， 該 斷裂形成具有平末端的 DNA 片段。 星號(hào)活性 （ 星活性 ）： 一些限制性內(nèi)切酶在某些反應(yīng)條件變化時(shí)酶專一性發(fā)生改變，如酶濃度過(guò)高、反應(yīng)液離子強(qiáng)度過(guò)低、 pH 改變、有機(jī)溶劑的影響等條件，酶切割位點(diǎn)專一性發(fā)生改變。同裂酶差別只在于當(dāng)識(shí)別順序