實(shí)驗(yàn)一微生物拮抗作用-展示頁(yè)
2025-04-13 23:19本頁(yè)面
【正文】 平板制備：將固體PDA培養(yǎng)基溶化后倒入培養(yǎng)皿中，制成平板(2) 棉花黃萎病菌液涂皿：將棉花黃萎病菌液用玻棒均勻的涂布在查氏平板培養(yǎng)基上(3) 枯草芽孢菌的接種：將圓濾紙片放置在平板培養(yǎng)基上，用吸管吸取少許枯草芽孢桿菌菌懸液滴到濾紙片上(4) 培養(yǎng)：28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天(5) 觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)二 酶聯(lián)免疫法測(cè)ABA含量?jī)x器： 酶聯(lián)免疫儀 酶標(biāo)板 752分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)原理 本方法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先將ABA蛋白質(zhì)復(fù)合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合,然后將待測(cè)的ABA(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中,進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng),接著棄去上清液,洗滌固相表面,加入酶標(biāo)二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反應(yīng),最后去除多余的未反應(yīng)的酶標(biāo)二抗,測(cè)定與固相結(jié)合的酶活性,酶活性和待測(cè)ABA含量呈負(fù)函數(shù)關(guān)系,即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標(biāo)二抗量(OD或B%)隨待測(cè)ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線,對(duì)于未知樣品B,只要在同樣條件下測(cè)定反應(yīng)后的OD值,就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到ABA的量?！渡锛夹g(shù)大實(shí)驗(yàn)》講義實(shí)驗(yàn)一 枯草芽孢桿菌對(duì)棉花黃萎病的拮抗作用 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?進(jìn)一步掌握無(wú)菌操作技術(shù)，加深對(duì)微生物之間互作的進(jìn)一步認(rèn)識(shí) 實(shí)驗(yàn)原理： 枯草芽孢桿菌分泌到體外的帶謝產(chǎn)物能夠抑制棉花黃萎病的生長(zhǎng) 供試菌株 (1) 拮抗菌株: 枯草芽孢桿菌（冰箱保存）(2) 病原菌株: 棉花黃萎病菌（冰箱保存） 實(shí)驗(yàn)步驟1. 培養(yǎng)基的制作(1) PD培養(yǎng)液：(2) PDA培養(yǎng)基：查氏培養(yǎng)液：按上述配方配制查氏液體50 ml及固體膠培養(yǎng)基125 ml分別裝在250的三角瓶中，121℃ 條件下滅菌30分鐘。2. 接種培養(yǎng)(1) 在無(wú)菌操作條件下，將棉花黃萎病菌接種在查氏培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)4天。測(cè)定方法 包被：在微量滴定板內(nèi)準(zhǔn)確加入100μLABA包被液，37℃濕盒過(guò)夜。 洗板：從37℃濕盒中取出滴定板，恢復(fù)到室溫后，棄去包被液，用WB（洗滌緩沖液）洗滌三次，甩干（吸水紙）。 洗板： 加酶標(biāo)二抗：每孔加100μL，37℃反應(yīng)1小時(shí)。 終止反應(yīng)：各孔加50μL 6NH2SO4。其中10號(hào)孔調(diào)零,而9號(hào)孔為最大值(B0),1~8號(hào)孔的OD值為B。實(shí)驗(yàn)三 質(zhì)粒DNA的提取及其酶切實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒DNA 。 ～，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。實(shí)驗(yàn)步驟（一） 提取質(zhì)粒1. 將2 ml 含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。3. 棄上清，吸盡殘液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。 5. 加200 ul溶液 Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管蓋，輕輕顛倒數(shù)次混勻，將離心管放冰上 5 min 。冰上放置 15 min 。8. 加入等體積酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反復(fù)混勻，12000 r/min，離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。12000r/min離心 5 min。10. 用1 ml 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。（二）酶切取DNA溶液，加酶切緩沖液，EcoRI酶1 ul，無(wú)菌水補(bǔ)至總體積10 ul，37℃保溫3h,加終止液，準(zhǔn)備下個(gè)實(shí)驗(yàn)電泳，分析質(zhì)粒DNA的限制性酶切圖譜。［實(shí)驗(yàn)原理］DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA, 也可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。 [實(shí)驗(yàn)步驟](一) 制備瓊脂糖凝膠電泳槽及用膠量將瓊脂糖按比例溶入1X TAE緩沖液中，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃, 加入適量EB, 混勻。2. 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。4. 待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，將膠槽放在電泳槽內(nèi)。 （三）加樣, 用移液器將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)5 V/cm。 （五）染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。細(xì)胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。2. 轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，加入16ml TENbf，充分混勻。3. 從水浴中取出離心管，加入5ml 5 mol/L KCl溶液，混勻，水浴20min。5. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一50ml離心管中。7. 加等體積氯仿，混勻，12000r／min 離心5min，取上清。放置時(shí)間9. 離心獲得沉淀，70％乙醇洗3次。10. 加入500μLTE緩沖液，溶解DNA。 實(shí)驗(yàn)六 PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誔CR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：PCR( Polymerase Chain Reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。這種延伸—變性—退火—延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次，使所需要的DNA片段得到特異性的擴(kuò)增。從理論上講，每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)25～30個(gè)循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。一、 儀器、實(shí)驗(yàn)用品
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