rna的提取ppt課件-展示頁
2025-01-26 15:21本頁面
【正文】 ．電泳和分光光度計定量 RNA。因絕大多數(shù)真核細胞 mRNA具有 3’端 PolyA+)尾，此引物與其配對，僅 mRNA 可被轉(zhuǎn)錄。二者雖同為 RNA→DNA 的過程，但地點不同，相對性的來說，逆轉(zhuǎn)錄在體內(nèi)，反轉(zhuǎn)錄在體外。艾滋病病毒(HIV)就是一種典型的 逆轉(zhuǎn)錄病毒 。反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量 PCR技術(shù)的原理及應用 (Reverse Transcription and Real time Quantitative PCR) 泰山醫(yī)學院 動脈粥樣硬化研究所 宋國華 RTPCR 逆轉(zhuǎn)錄（ reverse transcription）是以 RNA為模板合成DNA的過程，即 RNA指導下的 DNA合成。是 RNA病毒 的復制形式，需 逆轉(zhuǎn)錄酶 的催化。 逆轉(zhuǎn)錄與反轉(zhuǎn)錄嚴格意義上來說沒有什么區(qū)別，但是逆轉(zhuǎn)錄是 RNA類病毒自主行為，在整合到宿主細胞內(nèi)以 RNA為模板形成 DNA的過程；反轉(zhuǎn)錄是進行基因工程過程中，人為地提取出所需要的目的基因的信使 RNA，并以之為模板人工合成 DNA的過程。 實驗步驟 Oligo(dT)：是一種對 mRNA 特異的方法。由 Poly(A+)RNA僅占總 RNA 的 14%，故此種引物合成的 cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的 cDNA在數(shù)量和復雜性方面均要小。 2．反轉(zhuǎn)錄體系 :(20 μl) 37℃ 孵育 60min 3．將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行 PCR反應或熒光定量 PCR反應。 ? 兩步法 反轉(zhuǎn)錄和 PCR分開做， PCR取反轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物的 1/10進行，更為靈活而且嚴謹，但是靈敏度不如前者高。 ? RTPCR有時候也會指代實時 PCR(realtime PCR)。 Polymerase Chain Reaction (PCR) 一種模擬天然 DNA復制過程，在有 DNA模板、 DNA聚合酶（ Taq酶）、引物和四種 dNTP的情況下，通過高溫變性（ 90℃ 95℃ ） ,低溫退火（ 50℃ 65℃ ， 12min），中溫延伸（ 65℃ 75℃ ）這樣反復循環(huán)的過程中，在體外擴增特異性 DNA片段的分子生物學技術(shù)。 SYBR Green 實時熒光定量 PCR原理 SYBR Green I 工作原理 5’ 3’ 5’ 3’ SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SG SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ Emission Excitation 實時熒光定量 PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析 溫度 熒光強度 Tm Tm值： DNA解鏈一半時的溫度 實時熒光定量 PCR原理 SYBR Green I 熔解曲線分析 ? 將溫度與熒光強度的變化求導。 SYBR Green 法 優(yōu)缺點 ? 對 DNA模板沒有選擇性 適用于任何 DNA ? 使用方便 不必設(shè)計復雜探針 ? 非常靈敏 ? 便宜 優(yōu) 點 ? 容易與非特異性雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過 融解曲線的分析 ，優(yōu)化反應條件 ? 對引物特異性要求較高 缺 點 與目標序列互補 實時熒光定量 PCR 方法 2 TaqMan法 TaqMan水解型雜交探針 ? 5′ 端標記有報告基團 (Reporter, R) ，如 FAM、 VIC等 ? 3′ 端標記有熒光淬滅基團 (Quencher, Q) ? 探針完整， R所發(fā)射的熒光能量被 Q基團吸收 ，無熒光， R與 Q分開，發(fā)熒光 ? Taq酶有 5′→3′ 外切核酸酶活性，可水解探針 TaqMan法 工作原理 每擴增一條 DNA分子，釋放一個熒光信號，可以在循環(huán)過程中任一點檢測熒光 TaqMan 法 PCR反應的建立 引物、探針的設(shè)計： 探針 Tm為 6870℃ ， 30 bp, 5’不能有 G， G可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴增片段 400 bp，引物 Tm為 5960℃ 反應參數(shù)的確定：
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