【正文】 稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。 （ 3）轉(zhuǎn)化作用的先決條件是要獲得攜帶目的基因的重組 DNA分子。 表達(dá)體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提 純 產(chǎn)物活性 潛在危性 大腸桿菌 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 一般 對(duì)原核好 不大 融合蛋白質(zhì) 部分高產(chǎn) 對(duì)真核差 酵 母 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高產(chǎn) 稍復(fù)雜 天然產(chǎn)物 哺乳動(dòng)物 完 整 外分泌 較難成本高 簡(jiǎn)單 可達(dá)天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌 主要基因工程表達(dá)體系比較 （二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù) 轉(zhuǎn)化作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 轉(zhuǎn)化作用 （ 1）基本概念 （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 3）感受態(tài)細(xì)胞 （ 4）人工感受態(tài)細(xì)胞 （ 5）轉(zhuǎn)化程序 （ 6）影響轉(zhuǎn)化的因素 （ 1）基本概念 轉(zhuǎn)化 (transformation)： 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程 . （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。 缺點(diǎn)： （ 1）生產(chǎn) 慢 、 （ 2）生產(chǎn)率 低 、 （ 3）培養(yǎng)條件苛刻、費(fèi)用 高 ， （ 4）培養(yǎng)液濃度較 稀 。 ? 優(yōu)點(diǎn)： （ 1）有很強(qiáng)的 蛋白質(zhì)分泌能力 ， （ 2）能正確地進(jìn)行 翻譯后的加工 ，如進(jìn)行 糖基化 、肽剪切。 雖然酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)有糖基化修飾，但是 糖鏈結(jié)構(gòu)和組成與天然糖蛋白相差甚遠(yuǎn)， 對(duì)于那些糖鏈極大影響生物活性的蛋白質(zhì)，如 EPO、治療性抗體等，仍不能用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)。 優(yōu)點(diǎn)： （ 1）是研究基因表達(dá)調(diào)控 最有效 的單細(xì)胞真核生物， （ 2）其基因組小、繁殖迅速、可以利用廉價(jià)材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)， （ 3）無毒性， （ 4）基因工程操作簡(jiǎn)單， （ 5）表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接 分泌 出細(xì)胞外， （ 6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物 進(jìn)行糖基化 ， （ 7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。 （ 4）酵母菌 釀酒酵母 研究最為透徹。 （ 2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的 胞外蛋白酶 分泌系統(tǒng)，常常對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成 破壞 。 （ 2） 不會(huì)形成包含體 。 至 2022年， FDA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物 18種 ： 重組人甲狀旁腺激素、胰島素、生物激素、白介素、干擾素等主要為細(xì)胞因子類藥物。 （ 5）大腸桿菌內(nèi)的 蛋白酶 會(huì)對(duì)目的蛋白造成破壞。 （ 3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常形成 包含體 ，在提取后必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理才能恢復(fù)生物活性。 （ 2）細(xì)胞破碎時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的其它蛋白質(zhì)也會(huì)釋放出 來，形成雜質(zhì)。 （ 3） 基因工程研究中采用最多的表達(dá)體系。 （ 1）大腸桿菌 （ 2）枯草芽孢桿菌 （ 3）鏈霉菌 （ 4）酵母菌 （ 5）絲狀真菌 （ 6）動(dòng)物細(xì)胞 （ 1）大腸桿菌 優(yōu)點(diǎn)： （ 1） 生長(zhǎng)迅速、大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì) 。 宿主細(xì)胞的類型 原核細(xì)胞類： 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。 （ 11） 產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定、產(chǎn)率高。 （ 9） 容易進(jìn)行代謝調(diào)控。 （ 7）具有一定的細(xì)胞形態(tài)。 （ 5）發(fā)熱量低。 （ 3） 不致病。 （一）宿主細(xì)胞的選擇 （二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù) （三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （四）酵母菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （五）動(dòng)物細(xì)胞中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （一）宿主細(xì)胞的選擇 宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件 宿主細(xì)胞的類型 宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件 （ 1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。第三節(jié) 基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程 一、工具酶的分離純化 二、載體的分離純化 三、外源 DNA和目的基因的分離和獲得 四、外源 DNA與載體 DNA的切割與連接 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮? 六、基因工程菌的穩(wěn)定性及生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn) 七、基因工程菌中試 八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn) 九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù) 十、變性蛋白的復(fù)性 十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制 十二、基因工程藥物的制造實(shí)例 五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮? 體外重組的 DNA分子 ，如果不引入到宿主細(xì)胞，則無法顯示其生命力，而只是表現(xiàn)出 純粹的試劑性質(zhì) 。隨著時(shí)間的推移而 逐漸失活 。 （ 2）能夠利用廉價(jià)原料進(jìn)行生產(chǎn)。 （ 4） 不產(chǎn)生內(nèi)毒素 。 （ 6）需氧低。 （ 8）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度。 （ 10） 容易進(jìn)行 DNA重組技術(shù)操作。 （ 12） 產(chǎn)物容易提取和純化。 真核細(xì)胞類 ：酵母菌、絲狀真菌、動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì) 胞和植物細(xì)胞。 （ 2） 分子遺傳結(jié)構(gòu)清楚、操作簡(jiǎn)單 。 缺點(diǎn)： （ 1）表達(dá)產(chǎn)物多為 胞內(nèi)物質(zhì) ，提取時(shí)需破碎細(xì)胞。給提取帶來困難。 （ 4）大腸桿菌中不存在翻譯后修飾系統(tǒng)， 不能 對(duì)蛋白產(chǎn)物進(jìn)行 糖基化及磷酸化 等修飾。 （ 6）大腸桿菌會(huì) 產(chǎn)生內(nèi)毒素 ，難去除。 （ 2）枯草芽孢桿菌 優(yōu)點(diǎn)： （ 1） 分泌能力很強(qiáng) ，可以將蛋白質(zhì)產(chǎn)物 直接分泌到培養(yǎng)液中 。 缺點(diǎn)： （ 1） 不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化 。 （ 3）鏈霉菌 優(yōu)點(diǎn)： （ 1）不致病， （ 2）使用 安全 ， （ 3） 分泌 能力強(qiáng)， （ 4）可將培養(yǎng)產(chǎn)物直接