【正文】 測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法 ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈 S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。 間接法和夾心法 （ 2）競(jìng)爭(zhēng)法 因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出 S、 P和 N的吸光值。 /陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。 在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。測(cè)讀 A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用 492nm波長(zhǎng)。 1%，重復(fù)性達(dá) %。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。 酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀 ELISA光度計(jì)。 結(jié)果以光密度（ oplical density， OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（ absorbence， A），兩者含義相同。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。 TMB經(jīng) HRP作用后，約 40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至 2小時(shí)后即可完全消退至無色。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。 顯色 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。 可以說在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。 洗滌 洗滌在 ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。為什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？ 溫育常采用的溫度有 43℃ 、 37℃ 、室溫和 4℃ （冰箱溫度）等。 基本操作注意事項(xiàng) 保溫 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育 (incubation)。 加樣 在 ELISA中一般有 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。血漿和血清可同等應(yīng)用。 5 標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。 加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱； 在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。 4 對(duì)照設(shè)定 陽性對(duì)照品 (positive control)和陰性對(duì)照品 (negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。用 NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。 AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。 ABTS雖不如 OPD和 TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。 TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與 H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和 ABTS 。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達(dá) 6個(gè)月。 結(jié)合物的保存 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。過碘酸鈉將 HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 chiff氏堿而結(jié)合。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （ 1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié)。 辣根過氧化物酶 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 所有的 ELISA固相均需封閉？ ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性 結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。 常用封閉劑： %%的 BSA。 封閉 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面 。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原 可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。 包被的方式 將抗原或抗體固定的過程稱為包被 (coating)。 聚氯乙烯 ， 聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高 ， 但空白值也略高 。此法常用于病毒性感染的早期診斷。 捕獲包被法測(cè)抗體 IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。 C. 加酶標(biāo)抗體； D. 加底物。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法 。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。 只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體 ， 就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法 。底物的降解量＝抗原量。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 2 ELISA的類型 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。 加入酶反應(yīng)的底物后 ， 底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物 ， 產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) ， 故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析 。 ③ 在測(cè)定時(shí) ， 把受檢標(biāo)本 （ 測(cè)定其中的抗體或抗原 ） 和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng) 。 基本原理 ① 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面 ， 并保持其免疫活性 。 敏感性 化學(xué)比色法的敏感度為 mg/ml水平 酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為 510μg/ml 免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿 標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá) ng/ml水平 例如， HBsAg，其敏感度可達(dá) ?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。Ab的解離程度與 K值有關(guān)。Ab 抗體的親和力（ affinity），可以用平衡常數(shù) K表示：K=[Ag 酶免疫測(cè)定類型 這種固相酶免疫測(cè)定方法在 1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱 ELISA。免疫分析技術(shù)之 ELISA 廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王 娟 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 細(xì)胞水平 分子水平 基因水平 體外（或體內(nèi)）測(cè)定各類細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和效應(yīng)，從而了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平 測(cè)定各類免疫球蛋白 、補(bǔ)體 、 細(xì)胞因子及其受體 、 黏附分子的表達(dá)水平和生物活性 ，從而了解機(jī)體免疫因子間的相互關(guān)系 測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析 ELISA 概念 ?