【正文】 行有絲分裂。最后，在材料部位用大拇指用力垂直按壓，將載片蓋片之間壓實。因此， 45％冰乙酸也是一種褪色劑。另一個作用是使細胞質(zhì)褪色，起到細胞質(zhì)與染色體分色的作用。 9 壓片 用解剖針和鑷子截取 1/2 枚花藥置于載玻片上，然后滴上一滴 45％冰乙酸，并在酒精燈上加熱 3～ 5 秒鐘，注意切不可將冰乙酸加熱至沸騰。若染色時間不足，染色液就很難通過花藥壁細胞而進入花粉母細胞中， 影響觀察效果。 7 染色 將洗凈的花藥放入 0. 5％的蘇木精染色液中染色 4~24h。 6 水洗 媒染后的花藥要經(jīng)徹底水洗，洗凈花藥表面的鐵離子，否則花藥表面的鐵離子會與染色液反應(yīng)發(fā)生沉淀，影響染色效果。 5．媒染 剝離出來的花藥放進 4％硫酸高鐵銨 (鐵礬 )水溶液中進行媒染，媒染的時間需 4~24h。因此，在剝離花藥時要盡可能地多剝離一些大小不等的花藥，以保證能夠在實驗中觀察到減數(shù)分裂各個不同時期的圖象。 4 4 花藥剝離 每朵玉米雄性小花中的所有花藥幾乎都處于同一個減數(shù)分裂時期。保存材料時要注意使用封口嚴密的容器，最好使用廣口瓶，避免乙醇揮發(fā)。 3 保存 采集玉米雄花是有季節(jié)性和時間性的，因此每次要多采集一些，保存起來備用。取材時透過穎片可看到花藥，如果發(fā)現(xiàn)花藥是黃顏色的，說明減數(shù)分裂已經(jīng)結(jié)束，取材已晚。用手摸植株的上部 (喇叭口下部 )，有松軟彈性感覺，便可將旗葉一起抽出，扒開旗葉，剝離出雄花序。 3 器材 酒精燈、鑷子、解剖針、 50mL 燒杯、 10mL 燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙、量筒、顯微鏡。減數(shù)分裂的另一個特點是前期特別長，而且變化復(fù)雜，其中包括同源染色體聯(lián)會、交換與分離等。減數(shù)分裂的特點是性母細胞染色體只復(fù)制一次，然而連續(xù)進行兩次細胞分裂（即減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂），結(jié)果一個小孢子母細胞形成四個小孢子，每個細胞只含單倍數(shù)染色體，使原來細胞中的染色體數(shù)目減少一半。減數(shù)分裂是在性母細胞中進行的。 2 了解植物生殖細胞的形成過程及減數(shù)分裂過程各期的細胞學(xué)特征。 思考題 參照顯微鏡的觀察結(jié)果，繪制一套 較為完整的 植物根尖細胞 有絲 分裂過程的示意圖。凍片子時至凍透為止，切不可時間過長，否則細胞會凍裂。 9 永久裝片的制作 將制作好的片子放在凍片機上或液氮容器中將片子凍透，之后迅速用雙面刀片 將蓋片 揭開。 注意 觀察細胞 核 內(nèi)染色質(zhì)與染色體 結(jié)構(gòu)的特點。 壓片時先蓋上蓋片，在沒有用力壓之前，先用手固定住蓋片，用鑷子尖 在材料部位 垂直 輕敲幾下之后 ， 再 用拇指用力按壓 蓋片。 然后 ，再 滴上 石炭酸品紅 染液，染色 5 min 左右 ；醋酸洋紅或醋酸地衣紅要染 15～ 30 min。水洗時一定要洗凈，否則會影響染色效果。 6 水洗與低滲 解離后的材料要用清水或蒸溜水沖洗 3～ 5 次；酶解的材料洗后還要在水中浸泡 10～15min。酶的濃度以果膠酶和纖維素酶分別 為 2％～ 3％為宜 ，等量混合后使用。解離時要注意觀察，如果解離時間過長，分生組織會與伸長區(qū)脫離，這時分生區(qū)已經(jīng)被解離過軟，很難操作，而且染色效果不好。大蒜、洋蔥是百合科植物，纖維素、果膠質(zhì)的含量相對較低，解離時間 約為 4~5min。常用的解離方法有二種： (1)酸解：將 l mol／ L HCl放在 60℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱，當(dāng) HCl溫度達到 60℃ 時 ， 將根尖放入 HCl 溶液中。但是由于固定時間過長，材料 易 變脆 、 變硬，給實驗操作帶來一定困難。 固定的時間可根據(jù)被固定的材料大小而定，根尖組織固定 4～ 24h 可達到固定效果。 Carnoy 固定劑是用 3 份 95％的乙醇和 1 份冰乙酸配制成的。固定的目的是為了把細胞生活狀態(tài)的真實情況保存下來，避免在對細胞操作中使生活狀態(tài)發(fā)生改變。植物染色體數(shù)目多，個體小的適合于使用對二氯苯；而染色體中等長度的更適合于 8— 羥基喹啉，同時能使縊痕區(qū)更為清晰。如果處理時間過長，染色體會變得更短，不利于對染色體結(jié)構(gòu)進行研究。 (2)化學(xué)藥劑處理：常用的藥劑有 ％ ~0. 1％的秋水仙素水溶液；飽和對二氯苯溶液；～ mo1/L 8— 羥基喹啉等 。不同的植物對低溫的敏感程度不同，效果也不同 。 3 前處理 2 前處理的方法一般采用低溫處理和化學(xué)藥劑處理。 不同的植物 在 不同的環(huán)境條件， 其 細胞分裂高峰的時間是不同的。若實驗只需觀察 細胞 有絲分裂 的 過程 和 各 時期的 特征， 可將 根尖直接放入 Carnoy 固定液 (95％乙醇：冰乙酸 =3： 1)中固定；如果要觀察染色體形態(tài)和數(shù)目， 則 必須 對根尖 進行前處理后才能固定。玉米和蠶 豆種子 可 先用溫水浸泡 1 天之后， 再 轉(zhuǎn)入鋪有多層吸水紙或紗布的培養(yǎng)皿中，上面蓋雙層濕紗布置于 24～ 26℃ 溫箱中培養(yǎng)，每天換水二次。大蒜、洋蔥 易于在 水培、沙培、土培 條件下生根 。 操作方法 1 生根 植物 根尖是植物的 分生組織，取材容易，操作方便。 2 試劑 95％乙醇、冰乙酸、石炭酸品紅、 l mol／ L HCl。 這 十分便于對染色體的形態(tài)、數(shù)目進行觀察。 如 若 需要 進行染色體計數(shù)，則需進行前處理，即取材之后 采 用物理的或化學(xué)的方法，阻止細胞分裂過程中 紡錘 體的形成，使細胞分裂停止在中期。植物有絲分裂主要在根尖、節(jié)間、莖的生長點、芽及其它分生組織里進行。有絲分裂的目的是增加細胞的數(shù)量而使植物有機體不斷生長。 1 遺傳學(xué)實驗 指導(dǎo) 實驗 1 細胞 有絲分裂與減數(shù)分裂 實驗 植物根尖 細胞 有絲分裂過程的制片與觀察 目的要求 學(xué)習(xí)和掌握植物細胞有絲分裂制片技術(shù)；觀察植物細胞有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特 征及染色體的動態(tài) 行為 變化。 實驗原理 有絲分裂是植物體細胞進行的一種主要分裂方式。在有絲分裂過程中，細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)能準(zhǔn)確地進行復(fù)制，然后能有規(guī)律地均勻地分配到兩個子細胞中去。 將生長旺盛的植物分生組織經(jīng)取材 、 固定、解離、染色、壓片等處理即可以觀察到細胞 內(nèi)的 有絲分裂 圖象 。這時，染色體不排到赤道板上，而是散在整個細胞 質(zhì) 中。 試劑和器材 1 材料 均可以 大蒜 (Allium sativum 染色體數(shù)目 2n=16)、玉米 (Zea mays 染色體數(shù)目 2n=20)、洋蔥 (Allium cepa 染色體數(shù)目 2n=16)或 蠶豆 (Vicla faba 染色體數(shù)目 2n=12) 等根尖為實驗材料 。 3 器材 恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、水浴鍋、載玻片、蓋玻片、單面刀片、鑷子、培養(yǎng)皿、量筒、吸水紙。植物根 尖 細胞分裂旺盛，因此，它是 細胞有絲分裂相 制備 與觀察 的 理想 選取 部位。采用水培時要注意在暗處培養(yǎng)， 以 滿足根生長條件，使根系生長旺盛。 2 取材 待根長至 ~ cm 時，將根取下。取材 和固定 必須要在細胞分裂高峰期進行，即分裂細胞占細胞總數(shù)最大值時進行，這樣分裂細胞比例大，便于選擇 和 觀察。大蒜 和 洋蔥 的細胞分裂高峰期通常 是在上午 9～ 11 點，下午 15~17 點左右。 (1)低溫處理：將取材的根尖放入盛有蒸餾水的燒杯或其它容器內(nèi)，放在 1～ 4℃ 的冰箱或其它低溫條件下處理 24h。 對低溫較為敏感的植物是小麥。 秋水仙素溶液對紡錘體的抑制效果最好，一般在室溫條件下處理 2～ 4h 可達到理想的效果。 對二氯苯和 8— 羥基喹啉對不同的植物效果也不相同。 4 固定 固定是指用化學(xué)藥劑將細胞迅速殺死的過程。植物常用的固定劑是 Carnoy 固定劑。這二種藥品都具有迅速穿透細胞致細胞死亡的特點，但是乙醇是脫水劑，可使細胞脫水變形；冰乙酸又是一種膨脹劑，可使細胞膨脹改變生活狀態(tài)，把這二種藥品按照 3： l 配制使用，既可達到迅速殺死細胞又可保持細胞真實生活狀態(tài)的目的。固定時間過長， 可 去掉細胞中的一些脂肪油滴等，便于 染色體 觀察。 5 解離 解離的目的是將分生組織細胞之間的果膠質(zhì)和纖維素等物質(zhì)破壞掉，便于在制片過程中細胞容易散開。解離的時間要根據(jù)材料來確定。如果是禾本科植物的根尖， 酸解 時間要相對加長 些 。 (2)酶解：酶解時根尖的伸長區(qū)要去掉，只留下分生區(qū)。 酶解時溫度條件非常重要，溫度與解離時間成反比，溫度高，解離時間就短，但是溫度不得超過 45℃，否則酶會失去作用。水洗的另一個作用是后低滲，對 于 壓片有好處。 7 染色與壓片 取 根尖 分生組織的 1／ 3 左右 置 于載片上 ， 先用鑷子或解 剖針將分生組織碾碎，盡量鋪開 。為了增強染色效果，可在酒精燈上加熱幾秒鐘后繼續(xù)染一段時間。 8 鏡檢 壓好的片子要先放在低倍鏡下觀察，尋找不同分裂時期的典型細胞 分裂相 ， 然后，再 轉(zhuǎn)換成高倍鏡觀察 。選擇 典型的 細胞 分裂相 繪 3 圖?？諝飧稍锖螅枚妆酵该?，再用中性樹膠或加拿大樹膠封片。封片時要注意膠量不宜過多，樹膠既能達到蓋片的邊緣又沒有多余是最適量的。 實驗 玉米細胞減數(shù)分裂過程的制片與觀察 目的要求 1 學(xué)習(xí)和掌握植物細胞減數(shù)分裂制片方法。 實 驗原理 減數(shù)分裂是生物在形成配子時的一種特殊的分裂方式。減數(shù)分裂的結(jié)果是使二倍染色體數(shù)減為單倍染色體數(shù)，以便兩性配子結(jié)合時恢復(fù)形成二倍體生物。因此，將這種細胞分裂稱為減數(shù)分裂。 試劑和器材 1 材料 玉米 (Zea mays 染色體數(shù)目 2n=20) 2 試劑 95％乙醇、冰乙酸、硫酸高鐵銨、蘇木精。 操作方法 1 取材 采集正處于減數(shù)分裂時期的玉米雄花，此時雄花序尚未抽出旗葉，約 10 cm 長左右。取材的時間一般應(yīng)在上午 8:30～ 10 :30，下午 2 :00～ 4:00 為宜。 2 固定 將采集來的玉米雄花序放入新配制的 Carnoy 固定液（ 3 份 95%乙醇 : 1 份冰乙酸）中固定一周 (中間換二次固定液 )。固定好的材料先用 95％乙醇洗 3 次，然后轉(zhuǎn)入 70％乙醇中可長期保存。保存材料的乙醇每年要更換兩次，以保 證乙醇的濃度和材料的質(zhì)量。不同小花花藥之間可能處于不同的減數(shù)分裂時期。剝離花藥時要注意將小花穎片剝離干凈，使用的鑷子和解剖針不可刺破花藥，否則花粉母細胞可能會從傷口處外流，影響實驗效果。媒染的目的是讓花藥中的 花粉母細胞中浸入鐵離子，這些鐵離子可以和染色液發(fā)生反應(yīng)，增強染色體的染色效果。為了水洗徹底，可用尼龍網(wǎng)做一個小口袋，把花藥裝入口袋里，把口袋固定在水龍頭上，流水沖洗 5～ 10min。為了增強染色效果，可以在 25～30℃的溫箱里進行染色。 8 水洗 染色后的花藥還須清水沖洗，主要是洗凈花藥表面的染料。 45％冰乙酸的作用是軟化花藥壁細胞，使花藥壁破裂。如果加熱時間過長，也會把染色體上的顏色全部褪掉。 材料加熱之后，蓋上蓋片，用吸水紙折疊二層覆蓋在蓋片之上，用以吸收多余 的醋酸，然后，在蓋有花藥的部位用鑷子垂直輕輕敲打，使花藥內(nèi)的花粉母細胞擴散出來，肉眼觀察到花藥周邊有很多云霧狀細小顆粒即可。 10 鏡檢 顯微鏡下的細胞群中既有花粉母細胞，也有花藥壁細胞。因此，在觀察時要首先區(qū)分花粉母細胞和花藥壁細胞。一個花粉母細胞可相當(dāng)于 4～ 5 個花藥壁細胞的體積。 實驗 觀察 結(jié)果 由于同一枚花藥中花粉母細胞減數(shù)分裂具有同步分裂這一特點，所以在每枚花藥中一般只能看到減數(shù)分裂中的一個期。與其緊密相連的是一個看似十分圓滑的原球體，即核仁。 偶線期： 染色體進一步螺旋化進入偶線期。這時在顯微鏡下看到個別染色 體的某一點或端部具有雙重結(jié)構(gòu)或染色體配對的雙股結(jié)構(gòu)。由于同源染色體的聯(lián)會，玉米的染色體數(shù)目由原來的 20 條染色體變成 10 個二價體。另外，在玉米的某些染色體上存在著若干個深染的顆粒結(jié)構(gòu)，這些顆粒叫染色體結(jié)，是玉米粗線期的特有特征。由于配對的二價體在長軸上有一點或幾點結(jié)合著，而使二價體沒有完全分離。 終變期： 染色體高度濃縮使染色體變得更短更粗。終變期也是檢查染色體數(shù)目的最好時期之一，這時細胞核內(nèi)有多少個二價體，說明該生物就有多少對同源染色體。 減數(shù)第一次分裂的中期，端化的同源染色體排列在赤道面處。此時，核仁、核膜也已消失，紡錘體形成。由于染色體向兩極移動時，是以著絲點為先導(dǎo)的，具有兩個染色體比、開始解螺旋。核仁核膜重新出現(xiàn)，形成二個子核，每個子核的染色體數(shù)目減半為 n，即為單倍染色體數(shù)，但每條染色體由兩個姊妹染色單體所組成。但這兩個子細胞并不分開，一起進入減數(shù)第二次分裂，這兩個細胞又叫 二分體。通過這次有絲分裂，姊妹染色單體分離，細胞質(zhì)再次分裂，由原來的二分體（兩個細胞）變成了四分體（四個細胞）。但是每個細胞尚不具有授精能力。 思考題 1 參照顯微鏡的觀察結(jié)果，繪制一套玉米減數(shù)分裂過程的示意圖。 實驗 2 染色體制備與染色體組型分析 實驗 小白鼠骨髓染色體制備及觀察 目的要求 1 掌握動物骨髓細胞染色體制備技術(shù)