2組織培養(yǎng)第二章植物組織培養(yǎng)基本操作-文庫(kù)吧資料
2025-01-18 04:59本頁(yè)面
【正文】 （ 1）借助接種用工具將材料切割分離。 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表 滅菌劑 使用濃度 持續(xù)時(shí)間 去除的難易 效果 次氯酸鈣 910％ 530分鐘 易 很好 次氯酸鈉 2％ 530分鐘 易 很好 氯化汞 ％ 510分鐘 較難 最好 抗菌素 450mg／ L 3060分鐘 中 較好 酒精 7075% 易 好 過(guò)氧化氫 1012% 515分鐘 最易 好 三、外植體的接種 — 無(wú)菌接種 外植體的接種是把經(jīng)過(guò)表面滅菌后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)放到無(wú)菌培養(yǎng)基上的全部操作過(guò)程。滅菌時(shí)需進(jìn)行攪動(dòng)。 （ 3）接種用工具（解剖刀、剪刀、鑷子）可放入 7075%酒精中，使用時(shí)需火焰灼燒滅菌，冷卻后使用。 （ 2） 操作期間雙手和臺(tái)面常用 70%酒精或消毒劑擦拭 。 表面滅菌 （ 1） 操作人員穿戴滅菌過(guò)的工作服 、 口罩 。 二、預(yù)處理與表面滅菌 預(yù)處理 先對(duì)植物材料進(jìn)行修剪整理，去掉不需要部分，將準(zhǔn)備使用的植物材料（外植體）在流水中沖洗 2060分鐘，備用。 ⑵ 采收 從生長(zhǎng)健壯的無(wú)病蟲害的植株上選取發(fā)育正常的器官和組織 。 胚胎培養(yǎng)或脫毒在 。 快速繁殖時(shí)應(yīng)在植株生長(zhǎng)的最適時(shí)期取材 ， 花藥培養(yǎng)應(yīng)在花粉發(fā)育到單核期取材 。 ⑶控制濕度 給供體植株澆水時(shí)應(yīng)從根部給水，避免從上部澆水，以免上部形成易于病原侵染的濕度環(huán)境；盡可能降低溫室濕度；取材前盡可能保持植株干爽。 植株管理中應(yīng)注意： ⑴ 避免昆蟲危害 許多昆蟲如蚜蟲 、 螨類和飛虱是許多植物病蟲害的傳播媒介 ， 會(huì)引起植物組織的潛在感染 。對(duì)于培養(yǎng)過(guò)程中可能出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的材料，應(yīng)盡量取生長(zhǎng)旺盛期的生長(zhǎng)點(diǎn)部位作為起始培養(yǎng)的材料。同時(shí)，生長(zhǎng)在控制條件下的植物可以保持培養(yǎng)料間的一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，也便于培養(yǎng)技術(shù)的規(guī)范。 取自這些植物的外植體 ， 在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)有微生物滋生 ， 從而影響培養(yǎng)效果 。 一 、 植物材料的培養(yǎng)與取材 外植體 — 是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料，是植物離體培養(yǎng)的基礎(chǔ)材料。 培養(yǎng)基滅菌后如果出現(xiàn)過(guò)多沉淀或瓊脂不凝固等現(xiàn)象 ， 該培養(yǎng)基不能繼續(xù)使用 ， 應(yīng)查明原因重新配制 。 貯存室要保持無(wú)菌 、 干燥 、 以免造成培養(yǎng)基的二次污染 。 即將洗滌干凈的玻璃器皿放到烘箱中 ， 在150℃ 溫度下 ， 干熱滅菌 1小時(shí) ， 或 120℃ 下滅菌 2小時(shí) 。 取出培養(yǎng)基和器械冷卻 ， 貯存于 30℃ 以下室內(nèi) 。 繼續(xù)加壓至 108kPa（ ， 即 121℃） 壓力至 108kPa（ ， 即 121℃ ） 時(shí)， 穩(wěn)壓 在此壓力 1520min。 封閉高壓滅菌鍋各出氣口 。 （ 一 ） 高壓蒸汽滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般采用濕熱滅菌法： 培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)器械放入高壓滅菌鍋 。 液態(tài)培養(yǎng)基不使用凝固劑，但需要在容器中置入適當(dāng)?shù)闹挝?，試管為培養(yǎng)容器的支撐物可用濾紙橋，底面積較大的培養(yǎng)容器，支撐物可選用脫脂棉等。 培養(yǎng)基是離體培養(yǎng)物賴以生存和生長(zhǎng)的人工環(huán)境的重要組成部分 ， 常用的培養(yǎng)基依據(jù)其物理狀態(tài)的不同分為固態(tài)培養(yǎng)基和液態(tài)培養(yǎng)基 。 測(cè)試培養(yǎng)基溶液的 PH值 ()， 過(guò)高滴加 ， 過(guò)低滴加 NaOH調(diào)整 。 將母液混合液加入到加熱容器中 ， 攪拌混勻 。 向加熱容器中加入稱量好的 瓊脂 （%） ， 攪拌加熱 ， 至完全溶化 。 濃縮倍數(shù) 制備培養(yǎng)基數(shù)量 （ L） （ 二 ） 培養(yǎng)基制作程序 按大量元素 、 微量元素 、 鐵鹽 、 有機(jī)成分順序?qū)?母液 取出 ， 混合 。 KT和 BA等 細(xì)胞分裂素類： 先用少量 ， 再用蒸餾水定容至需要的體積 。 IAA、 NAA： 先用少量 95%酒精使之充分溶解 。 有機(jī)化合物 維生素 、 肌醇 、 氨基酸等一起配成 100或 200倍液 ，也可分別配制 。 微量元素 可配成 100— 200倍混合母液 ， KI可單獨(dú)配 。 制作培養(yǎng)基時(shí)根據(jù)需求制培養(yǎng)基數(shù)量取用母液 。 中鹽培養(yǎng)基 大量元素?zé)o機(jī)鹽為 MS的 1/2，微量元素種類減少含量增高，無(wú)肌醇維生素種類多，增加生物素、葉酸，有 H、 Hitsch、 Miller、 Blaydes等培養(yǎng)基，適用于特殊細(xì)胞培養(yǎng)。 N6培養(yǎng)基為水稻等禾谷類花藥培養(yǎng)設(shè)計(jì)，KNO3和（ NH4） 2SO4含量高 ,不含鉬。 低鹽培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽濃度低，有機(jī)成分含量低，多數(shù)作為生根培養(yǎng)基、胚胎培養(yǎng)使用，常用 White培養(yǎng)基。 （ 二 ） 幾種常用培養(yǎng)基 細(xì)胞工程常用的基本培養(yǎng)基有： MS、 MT、 White、 Nitsch、 Blaydes、 N B NT、 SH、 Miller、 Heller等 。 生根 培養(yǎng)基 誘導(dǎo)離體培養(yǎng)苗生根 根據(jù)營(yíng)養(yǎng)水平分： 基本 培養(yǎng)基 包含無(wú)機(jī)鹽等基本營(yíng)養(yǎng)成分。 繼代培養(yǎng)基 接種初代培養(yǎng)之后培養(yǎng)物的 培養(yǎng)基 。 二 、 常用培養(yǎng)基的種類 、 配方及特點(diǎn) （ 一 ） 培養(yǎng)基種類 根據(jù)態(tài)相分： 固體培養(yǎng)基 加凝固劑的培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑的培養(yǎng)基 。大部分抗生素需要過(guò)濾除菌。常受溫度影響，低溫吸附效果好，高溫吸附能力降低甚至解吸附。 ⑵活性炭 功能 常用的吸附劑，某些培養(yǎng)類型中，可以吸附培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的一些有毒物質(zhì)（酚類物質(zhì)），有利于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。 常用量 %%，不是培養(yǎng)基必需成分。 原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)及分生組織培養(yǎng)一般應(yīng)用雙蒸水或超純水 大批量快速繁殖培養(yǎng)，可用一般蒸餾水或純凈水。 有 20多種，目前主要是赤霉酸 GA3。
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