dna重組技術(shù)-文庫吧資料
2025-01-12 01:53本頁面
【正文】 表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、不經(jīng)濟(jì) 轉(zhuǎn)染 ： 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞 目 錄 真核表達(dá)載體 pcDNA3的物理圖譜 目 錄 表達(dá)載體 pFASTBACI 的物理圖譜 目 錄 目 錄 （一）利用定點(diǎn)突變可研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （二）定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)工程中有特殊的意義 二、基因定點(diǎn)突變技術(shù)可用于蛋白質(zhì)功能研究或改造蛋白質(zhì) 目 錄 三、 RNA干擾導(dǎo)致基因沉默可研究基因的功能 RNA干擾 (RNAi)的機(jī)制 目 錄 四、轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的生物學(xué)功能 （一）采用受精卵顯微注射可獲得轉(zhuǎn)基因小鼠 （二）基因打靶可修飾或替換固有基因 （三）利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立人類疾病的動(dòng)物模型 五、重組 DNA技術(shù)加速了基因工程藥物與疫苗的開發(fā) 目 錄 將篩選的ES注入內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 植 入 假孕 母 鼠子宮 胚胎干細(xì)胞 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) 胚泡 原核 受精卵 待轉(zhuǎn)入 基因 植入假孕母鼠子宮 同源重組敲出基因 篩 選 基 因敲出的 ES細(xì)胞 含目的基因的外源同源基因載體 雜 合子 后代交 配以 獲得純 合子 轉(zhuǎn)基因 或基 因敲出動(dòng)物 檢測子代是否存在轉(zhuǎn)移基因或基因敲出 制備轉(zhuǎn)基因小鼠和小鼠基因打靶示意 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)凝血 顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成 生長因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長與分化 生長素 治療侏儒癥 胰島素 治療糖尿病 干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤 白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞 超氧化物歧化酶 抗組織損傷 單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療 乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝 口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂 目 錄 目 錄 基因診斷 (gene diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 ， 在 DNA水平分析 、 鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換 、 缺失或插入等突變 。 目 錄 組織或細(xì)胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 * 從基因組 DNA文庫獲取目的基因 限制酶切位點(diǎn) 限制酶消化 除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應(yīng) 體外包裝 用重組噬菌體 感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫 目 錄 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 * 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 目 錄 目 錄 （三）利用分子探針篩選 cDNA文庫可分離特異編碼序列 （二）利用核酸雜交從全基因組 DNA文庫中獲取目的基因 與篩選基因組文庫不同的是 ， 只能用 cDNA序列或基因組 DNA編碼序列做探針來篩選 cDNA文庫 。 如果對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控或編碼區(qū)的間隔序列感興趣 ， 則選擇基因組DNA克隆的策略 。 這需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇 。 目 錄 5? 3? 3? 5? 載體 DNA 5? 3? 3? 5? 目的基因 限制酶或機(jī)械剪切 限制酶 5? 3? 3? 5? 5? 3? 3? 5? λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 5? 3?T(T)nT T(T)nT 3? 5? 5? 3?A(A)nA A(A)nA 3? 5? 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15℃ 重組體 目 錄 目 錄 人工接頭 (linker)連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接 。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGATCCGGATCCG載
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