【正文】 166 172 173Aspergillus brasiliensis IMI 381727 C C T CAspergillus niger ATCC 16888 A T A ACMCC(F)98003 A T A A注 : 2:β 微管蛋白基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果 .Note: M: DL2023 marker。growth.表 碳源利用情況Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC16888Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麥芽糖Maltose+ ? +β甲基 D葡萄糖苷βMethylDGlucoside+ ? +D海藻糖DTrehalose+ ? +L蘋果酸LMalic Acidv + ?α酮戊二酸αKetoglutaric acid? w ?苦杏仁苷Amygdalin+ ? +D果糖DFructose+ v +四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 n ITS rDNA區(qū)序列 分析圖 CMCC(F)98003的 ITS rDNA區(qū)序列和 β 微管蛋白基因序列 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig ITS rDNA and βtubulin gene PCR amplification results of CMCC(F)98003注 : M: DL2023 marker。v:growth。w:growth。+:growth。?:v:微弱 (邊界 )生長 。+:沒有生長 。 C: Conidial morphology ( 400).該菌株的形態(tài)學(xué)特征符合黑曲霉 A. niger的形態(tài)特征四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 n Biolog鑒定注 : B: 分生孢子梗形態(tài) ( 100)。C 培養(yǎng) 7 d菌種的宏觀形態(tài)和顯微形態(tài)Fig Macromorphology and micromorphology on 25176。C保存 。 72176。C 1 min, 72176。 94176。反 應(yīng) 程序：94176。 Taq DNA聚合 酶 ( U/μL) μL。 dNTP (每種 mmol/L) 8 μL。GACCCTTGGC3?反 應(yīng) 體系：100 μL, 10 擴(kuò) 增 緩 沖液 10 μL。 Bt2b:5?GGTAACCAAATCG5?GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3?n β微管蛋白基因序列 分析168。5?TCCTCCGCTTATTGATATGC3?168。 生長濁度試驗(yàn)n ITS rDNA區(qū)序列 分析168。C培養(yǎng) 7 CYA培養(yǎng)基 ,n各類 標(biāo)準(zhǔn)中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株 (CMCC(F) 98003) ,需要重新復(fù)核鑒定 。 16404TM and ATCC174。 16404TM and ATCC174。 ta To180。ndor Kocsube180。rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹infB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 2023年 Aspergillus brasiliensis 2023年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis . 2023年 USP　將 ATCC 16404 更名 2023年 WDCM 將 ATCC 16404 更名 圖： ATCC 16888和 ATCC 16404的培養(yǎng)特征和顯微形態(tài)a180。 PCRSSCP是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與單鏈 DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)結(jié)合，利用不同構(gòu)象單鏈 DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異 , 檢測出 DNA短片段中存在的單核苷酸突變 ,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種基因多態(tài)性的研究。 BOXPCR根據(jù) BOX插入因子 (大小為 154 bp, 由保守性不同的 box A(57 bp)、 box B(43 bp)和 boxC(50 bp)等亞單位組成)設(shè)計(jì)引物 , 擴(kuò)增微生物基因組 DNA 的重復(fù)性片段 , 最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態(tài)性。Dickinson)n 將傳統(tǒng)的生化反應(yīng)、酶 — 底物呈色反應(yīng)與熒光增強(qiáng)顯色技術(shù)結(jié)合，設(shè)計(jì)鑒定反應(yīng)最佳組合。Crystal(mycoplasm)醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 四、微生物鑒定 生理生化n APIcellwallthickerabutouterhave(Escherichia coli)cellamembranesandhave醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 四、微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 四、微生物鑒定 生理生化碳源和氮源 運(yùn)動性細(xì)胞壁組成 滲透耐性能源 氧關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物 最適 pH和生長范圍一般營養(yǎng)類型 光合作用色素最適生長溫度和范圍 鹽需求及耐性發(fā)光 次級代謝產(chǎn)物形成能量轉(zhuǎn)換機(jī)制 對代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內(nèi)含物醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 四、微生物鑒定 生理生化Division based on membrane position:a) gramnegatived后 ，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 和 無性繁殖方式等 。微觀形態(tài)（細(xì)胞特征）將培養(yǎng)物在 30℃ 條件下培養(yǎng) 16~24小時，挑取對數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進(jìn)行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小 等細(xì)胞特征。25℃溫箱中進(jìn)行培養(yǎng) 7天。d后，進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，菌落質(zhì)地 、 菌落顏色 、 菌落表面是否為反光或暗淡 、 菌落是平伏還是隆起 、 菌落邊緣 等 。D1/D2區(qū)其他醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 四、微生物鑒定 形態(tài)學(xué)觀察細(xì)菌 酵母 絲狀真菌宏觀形態(tài)（培養(yǎng)特征）將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布， 30℃ 培養(yǎng) 16~24小時，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等 。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞特征培養(yǎng)特征生理生化試驗(yàn)生長溫度耐鹽性碳源利用發(fā)酵產(chǎn)酸其他化學(xué)成分分析呼吸醌極性脂脂肪酸分枝菌酸氨基酸和糖其他基因型分析核酸序列分析功能基因分析DNA雜交指紋圖譜、 菌株分型其他系統(tǒng)發(fā)育分析16SEscherichia coliβgalactosidase 利用微生物自身代謝產(chǎn)生的 酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色 的原理來檢測微生物的培養(yǎng)基。n 堿性瓊脂： 用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。n 麥康凱平板： 具中等強(qiáng)度選擇性，抑菌力略強(qiáng)，有較少革蘭陰性菌不生長。n 營養(yǎng)肉湯： 用于標(biāo)本及各類細(xì)菌的增菌n 巧克力血平板： 其中含有 V和 X因子，適于接種疑有 嗜血桿菌、奈瑟菌 等的標(biāo)本。指示（鑒別）能力醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 選擇培養(yǎng)基分離168。促生長能力168。 單細(xì)胞分離法對 操作技術(shù) 有比較高的要求。 168。168。醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 單細(xì)胞（孢子）分離168。在同一個稀釋度的許多平行試管中， 大多數(shù)（一般應(yīng)超過 95%）表現(xiàn)為不生長。稀釋法 是液體培養(yǎng)基分離純化常用的方法。不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物 仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間 梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中 培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而 培養(yǎng)基內(nèi)部 菌落呈 豆?fàn)罨蛲哥R狀 。曲線法 ：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。四格法醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 平板劃線法斜線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿 70176。方格法168。斜線法168。選擇培養(yǎng)基分離法醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2023 涂布平板法少量樣