【正文】 酵過(guò)程中，菌體不斷利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解氧化而產(chǎn)生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如 ATP）提供細(xì)胞合成和代謝產(chǎn)物合成需要的能量，其余一部分以熱的形式散發(fā)出來(lái)，這散發(fā)出來(lái)的熱就叫生物熱。發(fā)酵熱大，溫度上升快，發(fā)酵熱小，溫度上升慢。這各種產(chǎn)生的熱量和各種散失的熱量的代數(shù)和就叫做凈熱量。 所謂發(fā)酵熱就是發(fā)酵過(guò)程中釋放出來(lái)的凈熱量。要通過(guò)反復(fù)實(shí)踐來(lái)定出最適溫度。培養(yǎng)條件適宜，如營(yíng)養(yǎng)豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長(zhǎng)。因?yàn)闇囟雀郀I(yíng)養(yǎng)利用快，會(huì)使菌過(guò)早自溶。 通氣條件差時(shí)可適當(dāng)降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。 如黑曲霉生長(zhǎng)溫度為 370C， 谷氨酸產(chǎn)生菌棒狀桿菌的生長(zhǎng)溫度為 30～ 320C， 青霉菌生長(zhǎng)溫度為 300C。因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的溫度要嚴(yán)格控制。 從阿累尼烏斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 積分得 E= 2112/1/1/TTKK rr?E—— 活化能 Kr—— 速率常數(shù) 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 97 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 溫度影響發(fā)酵方向 四環(huán)素產(chǎn)生菌金色鏈霉菌同時(shí)產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素，當(dāng)溫度低于 300C時(shí)，這種菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例也提高，溫度達(dá)到 350C時(shí)，金霉素的合成幾乎停止，只產(chǎn)生四環(huán)素。 若要控制消后 pH在 ， 消前 pH往往要調(diào)到 ~ 在基礎(chǔ)料中加入維持 pH的物質(zhì) ， 如CaCO3 ，或 具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等 通過(guò)補(bǔ)料調(diào)節(jié) pH 94 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 在發(fā)酵過(guò)程中根據(jù)糖氮消耗需要進(jìn)行補(bǔ)料 。 谷氨酸發(fā)酵 ， 在中性和微堿性條件下積累谷氨酸 ，在酸性條件下則容易形成谷氨酰胺和 N乙酰谷氨酰胺 92 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 3 pH在微生物培養(yǎng)的不同階段有不同的影響 生長(zhǎng) 合成 pH對(duì)菌體生長(zhǎng)影響比產(chǎn)物合成影響小 例 青霉素：菌體生長(zhǎng)最適 ~,~ 四環(huán)素：菌體生長(zhǎng)最適 ~， ~ X pH 四環(huán)素 93 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 pH的控制 調(diào)節(jié)好基礎(chǔ)料的 pH。 當(dāng) pH值抑制菌體某些酶的活性時(shí)使菌的新陳代謝受阻 （ 2） pH值影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的改變，從而改變細(xì)胞膜的透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進(jìn)行 （ 3） pH值影響培養(yǎng)基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用 2 pH對(duì)發(fā)酵的影響 91 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 （ 4） pH影響代謝方向 pH不同 ， 往往引起菌體代謝過(guò)程不同 ， 使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變 。 發(fā)酵 15小時(shí)左右 ， pH值可以從消后的 ，調(diào)節(jié)這一段的 pH值至 ， 以后自控 pH， 可提高發(fā)酵單位 。 若不及時(shí)補(bǔ)糖 、 (NH4)2SO4或酸 ， 發(fā)酵液 pH可迅速升到 ，阻礙或抑制某些酶系 ， 使林可霉素增長(zhǎng)緩慢 ， 甚至停止 。 菌體自溶 ， pH上升，發(fā)酵后期， pH上升。 （ 3）生理酸堿性物質(zhì)利用后 pH會(huì)上升或下降 88 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 產(chǎn)物形成 某些產(chǎn)物本身呈酸性或堿性，使發(fā)酵液 pH變化。 發(fā)酵過(guò)程中 pH是不斷變化的，通過(guò)觀察 pH變化規(guī)律可以了解發(fā)酵的正常與否 87 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 發(fā)酵過(guò)程 pH變化的原因 基質(zhì)代謝 （ 1）糖代謝 特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使 pH下降。生物法常用于發(fā)酵終了產(chǎn)品效價(jià)的測(cè)定。 適用于抗生素效價(jià)的測(cè)定 生物法以抗生素的殺菌能力為衡量效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn) ， 其原理恰好與臨床應(yīng)用的要求相一致，而且此法靈敏度高，需用的檢品量較小，這是其它方法不能比的。 物理法 許多酶、抗生素都有不對(duì)稱碳原子，具有旋光性，因此可以通過(guò)測(cè)定旋光度來(lái)測(cè)定酶或抗生素的含量。 藍(lán)色麥芽酚鏈霉素加熱，－ ? ?????? ?? ?? 22, FeOHOH淀粉酶活力測(cè)定：在 1%可溶性淀粉溶液中加入淀粉酶，所釋放出的麥芽糖與生色試劑（ 3， 5二硝基水楊酸與酒石酸鉀鈉的堿溶液）產(chǎn)生顏色，它在 540nm處所得吸光度跟淀粉酶活力成正比。同一種酶用不同的方法測(cè)定會(huì)有不同的酶活單位，容易造成混亂，為此國(guó)際上作了統(tǒng)一規(guī)定，規(guī)定在250C下， 以最適的底物濃度，最適的緩沖液離子強(qiáng)度，以及最適的 pH諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微克分子底物的酶定量為一個(gè)活性單位。 76 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 產(chǎn)物量的測(cè)定 產(chǎn)物量的特殊表示法 抗生素效價(jià)的表示 抗生素效價(jià)表示抗生素的有效成分的多少，效價(jià)大小用單位（ U）來(lái)表示 效價(jià)表示方法：重量折算法 重量單位 類似重量單位 特殊單位 77 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 重量折算單位：以最低抑菌濃度為一個(gè)單位，如青霉素 ＝ 1U 重量單位：規(guī)定某些抗生素活性部分1μg=1u 如鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等定義活性部分 1μg＝ 1u 78 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 類似重量單位：規(guī)定抗生素的某種鹽1mg=1000u如金霉素、四環(huán)素的鹽酸鹽定一為 1μg＝ 1u 特殊單位：藥檢所制定某些抗生素的單位 制霉菌素 1mg=3700u 多粘菌素 B 1mg=10000u 79 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 酶活力的表示法 酶活力用單位來(lái)表示。 73 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 74 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 75 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 產(chǎn)物濃度 在培養(yǎng)過(guò)程中，產(chǎn)生菌的合成能力和產(chǎn)物積累情況都要通過(guò)產(chǎn)物量的測(cè)定來(lái)了解，產(chǎn)物濃度直接反映了生產(chǎn)的狀況 ,是發(fā)酵控制的重要參數(shù)。 菌形態(tài) 顯微鏡觀察 菌濃度的測(cè)定是衡量產(chǎn)生菌在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中菌體量的變化，一般前期菌濃增長(zhǎng)很快，中期菌濃基本恒定。因此磷在培養(yǎng)基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取補(bǔ)磷措施。 71 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 磷含量 微生物體內(nèi)磷含量較高，培養(yǎng)基中以磷酸鹽為主，發(fā)酵中用來(lái)計(jì)算磷含量的是磷酸根。通過(guò)氨基氮和氨氮的分析可控制發(fā)酵過(guò)程，適時(shí)采取補(bǔ)氨措施。 但是氮源太多會(huì)促使菌體大量生長(zhǎng)。 氨氮 指無(wú)機(jī)氨中的氮（ NH3N）。 70 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 氨基氮和氨氮 氨基氮 指有機(jī)氮中的氮（ NH2N），單位是 mg/100ml。如發(fā)酵中的淀粉、飴糖、單糖等各種糖 。 糖含量測(cè)定包括總糖和還原糖。 69 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 糖含量 微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成與糖代謝有密切關(guān)系。對(duì)于這種工藝，后期的補(bǔ)料控制是關(guān)鍵。 67 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 RQ值隨微生物菌種的不同，培養(yǎng)基成分的不同，生長(zhǎng)階段的不同而不同。 65 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 發(fā)酵過(guò)程主要分析的項(xiàng)目 目前發(fā)酵過(guò)程主要分析項(xiàng)目如下 pH pH與微生物的生命活動(dòng)密切相關(guān) —— 酶催化活性 pH的變化又是微生物代謝狀況的綜合反映 —— 基質(zhì)代謝、產(chǎn)物合成、細(xì)胞狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、供氧狀況 66 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 排氣氧、排氣 CO2和呼吸熵 排氣氧的濃度表征了進(jìn)氣的氧被微生物利用以后還剩余的氧，因此排氣氧的大小反映了菌生長(zhǎng)的活性，通過(guò)計(jì)算可以求得攝氧率（ OUR）。因?yàn)槲⑸飩€(gè)體極微小，肉眼無(wú)法看見(jiàn)，要了解它的代謝狀況，只能從分析一些參數(shù)來(lái)判斷，所以說(shuō)中間分析是生產(chǎn)控制的眼睛。 一般來(lái)說(shuō)微生物在不同體積的反應(yīng)器中的生長(zhǎng)速率是不同的，原因可能是，罐的深度造成氧的溶解度、空氣停留時(shí)間和分布不同，剪切力不同，滅菌時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分破壞程度不同所致。 60 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 生產(chǎn)規(guī)模放大 ： 在大型發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。在搖瓶試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察溶氧、攪拌等搖瓶上無(wú)法考察的參數(shù)，以及在反應(yīng)器中微生物對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)成分的利用速率、生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物合成速率及其它一些發(fā)酵過(guò)程參數(shù)的變化，找出過(guò)程控制的最佳條件和方式。 搖瓶研究的優(yōu)點(diǎn)是工作量大，可以一次試驗(yàn)幾十種甚至幾百種條件，對(duì)于菌種培養(yǎng)條件的優(yōu)化有較高的效率。 58 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 研究的層次 初級(jí)層次的研究 ： 一般在搖瓶規(guī)模進(jìn)行試驗(yàn)。用少量的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)數(shù)理分析得到單因子實(shí)驗(yàn)同樣的結(jié)果，甚至更準(zhǔn)確，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。如正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、響應(yīng)面設(shè)計(jì)。一般用搖瓶做實(shí)驗(yàn) 優(yōu)點(diǎn) 一次可以進(jìn)行多種條件的實(shí)驗(yàn)，可以在較快時(shí)間內(nèi)得到的結(jié)果。 為了全面的認(rèn)識(shí)發(fā)酵過(guò)程，本章首先要告訴大家分析發(fā)酵過(guò)程的基本方面，在此基礎(chǔ)上再舉一些例子，說(shuō)明如何綜合分析發(fā)酵過(guò)程及進(jìn)行優(yōu)化放大。 55 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 發(fā)酵過(guò)程受到多因素又相互交叉的影響如菌本身的遺傳特性、物質(zhì)運(yùn)輸、能量平衡、工程因素、環(huán)境因素等等。 微生物的生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成有密切相關(guān)性，不僅表現(xiàn)在菌體量的大小影響產(chǎn)物量的多少，而且菌體生長(zhǎng)正常與否，即前期的代謝直接影響中后期代謝的正常與否。 52 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 發(fā)酵過(guò)程工藝控制的目的 有一個(gè)好的菌種以后要有一個(gè)配合菌種生長(zhǎng)的最佳條件，使菌種的潛能發(fā)揮出來(lái) 目標(biāo)是得到最大的比生產(chǎn)速率和最大的生產(chǎn)率 53 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 發(fā)揮菌種的最大生產(chǎn)潛力考慮之點(diǎn) ?菌種本身的代謝特點(diǎn) 生長(zhǎng)速率、呼吸強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)要求（酶系統(tǒng)）、代謝速率 ?菌代謝與環(huán)境的相關(guān)性 溫度、 pH、滲透壓、離子強(qiáng)度、溶氧濃度、剪切力等 54 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 微生物代謝是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，它的代謝呈網(wǎng)絡(luò)形式，比如糖代謝產(chǎn)生的中間物可能用作合成菌體的前體，可能用作合成產(chǎn)物的前體，也可能合成副產(chǎn)物，而這些前體有可能流向不同的反應(yīng)方向，環(huán)境條件的差異會(huì)引發(fā)代謝朝不同的方向進(jìn)行。由于 μ＝ D，通過(guò)改變稀釋速率可以比較容易的研究菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué) 缺點(diǎn) 菌種不穩(wěn)定的話，長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)會(huì)引起菌種退化，降低產(chǎn)量。 51 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 控制稀釋速率可以使發(fā)酵過(guò)程最優(yōu)化。 缺點(diǎn) 代謝產(chǎn)生的前體物被稀釋，提取的總體積增大 50 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 連續(xù)培養(yǎng) 發(fā)酵過(guò)程中一邊補(bǔ)入新鮮料液一邊放出等量的發(fā)酵液，使發(fā)酵罐內(nèi)的體積維持恒定。由于有物料的加入增加了染菌機(jī)會(huì) 49 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 半連續(xù)培養(yǎng) 在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上間歇放掉部分發(fā)酵液（帶放）稱為半連續(xù)培養(yǎng)。 48 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 補(bǔ)料分批培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 在這樣一種系統(tǒng)中可以維持低的基質(zhì)濃度，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；可以通過(guò)補(bǔ)料控制達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件；還可以利用計(jì)算機(jī)控制合理的補(bǔ)料速率，穩(wěn)定最佳生產(chǎn)工藝。 在此過(guò)程中只有料液的加入沒(méi)有料液的取出，所以發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液體積比發(fā)酵開(kāi)始時(shí)有所增加。整個(gè)過(guò)程中菌的濃度、營(yíng)養(yǎng)成分的濃度和產(chǎn)物濃度等參數(shù)都隨時(shí)間變化。 s0 μ 當(dāng)只有 B時(shí)建立穩(wěn)態(tài)： μB=D,對(duì)應(yīng) S0 如果引入微生物 A： μ= μA (S0) μA D x增加 s下降 μA μB下降 μBD被洗出 41 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 3 發(fā)酵過(guò)程的代謝控制 ? 發(fā)酵過(guò)程控制是發(fā)酵的重要部分 ? 控制難點(diǎn)：過(guò)程的不確定性和參數(shù)的非線性 ? 同樣的菌種，同樣的培養(yǎng)基在不同工廠，不同批次會(huì)得到不同的結(jié)果，可見(jiàn)發(fā)酵過(guò)程的影響因素是復(fù)雜的，比如設(shè)備的差別、水的差別、培養(yǎng)基滅菌的差別，菌種保藏時(shí)間的長(zhǎng)短，發(fā)酵過(guò)程的細(xì)微差別都會(huì)引起微生物代謝的不同。 產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)的基本概念 28 淮海工學(xué)院海洋學(xué)院 Gaden對(duì)發(fā)酵的三分類與 Pirt方程： 〖一類發(fā)酵〗 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián) x p 29 淮海工學(xué)院海