第三章-核酸擴增技術(shù)課件-文庫吧資料
2024-08-28 23:37本頁面
【正文】 的制備 。 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) ?多重 PCR必須滿足的兩個條件： ? PCR反應(yīng)條件適合所有被擴增的 DNA片段 ? 同一反應(yīng)內(nèi)各擴增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測時能通過電泳將各片段充分分離 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （四）多重 PCR技術(shù) 現(xiàn)在位置 P179 目 錄 （五） PCR誘導定點突變 DNA重組技術(shù)使我們能夠首先用各種方法對克隆的 DNA片段進行突變，在對產(chǎn)生的突變作 DNA序列分析以后，再對突變體的特殊功能作進一步研究。 現(xiàn)在位置 174 目 錄 （二）、巢式 PCR ?巢式 PCR（ nested PCR）是對靶基因進行 二次擴增 。 ? 由于耐熱的 DNA聚合酶不能以 RNA或 mRNA作為模板，因此首先必須將總 RNA或 mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，以生成與之互補的cDNA，然后 再以 cDNA作為模板進行 PCR擴增 ，得到所需的目的基因片段。 現(xiàn)在位置 P174 目 錄 （二） PCR技術(shù)的質(zhì)量保證 PCR技術(shù)用于臨床檢驗的質(zhì)量保證主要涉及 基因擴增檢驗全過程 的質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)量控制 和 室間質(zhì)量評價 。 ? 這四個區(qū)域必須 互相獨立 ，并嚴格 按照上述順序設(shè)置 。 現(xiàn)在位置 P173 目 錄 循環(huán)次數(shù) ?循環(huán)次數(shù)一般為 20～ 45次。 ?在模板（尤其是基因組 DNA）進行 第 1次變性時應(yīng)給予足夠長的時間 （ 5～ 7分鐘，根據(jù)變性溫度高低而異）以使模板徹底變性，然后再進入循環(huán)。 現(xiàn)在位置 P172 目 錄 時間 ?PCR循環(huán)中每個步驟所需的 時間 取決于 所擴增片段的長度 。 ② 退火溫度：退火溫度決定 PCR反應(yīng)的特異性，退火溫度的設(shè)定取決于引物的 Tm，通常 PCR的退火溫度應(yīng) 低于引物 Tm 5℃ 左右。 6. 根據(jù)需要，合成引物時 在其 5’ 端可以加修飾成分 如加入 酶切位點 ，用 生物素、熒光素、地高辛等標記 ，引入 突變位點 ，引入 啟動子序列 ，引入 蛋白質(zhì)結(jié)合 DNA序列 等。 ① C＋ G的比例一般為 45~55%。 現(xiàn)在位置 P170 目 錄 引物設(shè)計時必須遵循的原則（ 6條） 1. 用于 PCR反應(yīng)的引物需要 二條 ，分別設(shè)在被擴增目標片段的 二端 ，并分別與模板正負鏈 序列互補 。 ? 一般為 現(xiàn)在位置 P172 目 錄 引物 (Primer) ? 引物是 化學合成 的 已知序列的寡核苷酸(oligonucleotide)分子 。 ?濃度過高會加快反應(yīng)速度，但導致非特異性擴增 ?降低在 dNTP濃度會提高反應(yīng)的特異性 ?一般為 20~200umol/L 現(xiàn)在位置 P170 目 錄 鎂離子濃度 ? 鎂離子濃度在擴增反應(yīng)中是一個至關(guān)重要的因素，因為鎂離子對于 反應(yīng)系統(tǒng)本身 、 穩(wěn)定核苷酸 和 提高 Taq DNA聚合酶的活性 有直接的影響。 現(xiàn)在位置 P170 目 錄 dNTPs ?即 dATP、 dCTP、 dGTP和 dTTP四種脫氧核苷三磷酸的混合物。 現(xiàn)在位置 P125 目 錄 耐熱 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 （ Taq DNA polymerase）是從一種生活在熱泉（ 80～ 90℃ ）中的水棲噬熱菌（ Thermus aquaticus）中提取的，有很高的耐熱穩(wěn)定性。 現(xiàn)在位置 P125 目 錄 PCR的基本反應(yīng)過程 變性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm5?C 現(xiàn)在位置 P170 （ 4070 ?C） 目 錄 PCR的擴增效率 現(xiàn)在位置 P170 循環(huán)次數(shù) ： 0 1 2 3 … n 產(chǎn)物數(shù)量 ： 2 2 2 2 … 2 0 1 2 3 n ?每一次循環(huán)后，一分子模板被擴增為兩個分子 ?每個循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段，即為下一個循環(huán)的模板 ?PCR產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長 目 錄 1. 模板 DNA 2. 特異性引物 3. 耐熱 DNA聚合酶 4. dNTPs 5. Mg2+ 二、 PCR體系基本組成成分 現(xiàn)在位置 P170 目 錄 1. 模板 DNA 2. 特異性引物 3. 耐熱 DNA聚合酶 4. dNTPs 5. 緩沖液 二、 PCR體系基本組成成分 現(xiàn)在位置 P170 目 錄 模板 (template) 模板 就是將要被復制的核酸片段，包括基因組 DNA、 RNA、質(zhì)粒 DNA和線粒體 DNA等。 基礎(chǔ)知識 目 錄 基礎(chǔ)知識 目 錄 基礎(chǔ)知識 dNTP ? dATP ? dCTP ? dGTP ? dTTP dNTP 目 錄 PCR概念：在 體外 特異地 復制 一段 已
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