【正文】 明光源。這就需要一種更大分辮力的儀器來觀察比?m更小的物體的微細結(jié)構(gòu)。 近場掃描光學(xué)顯微鏡技術(shù)將對研究活體中的病毒和染色體等生物物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)揮作用。 近場掃描光學(xué)顯微鏡技術(shù)的理論分辨率極限約10nm。調(diào)節(jié)滑行器可使標本的細微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。于是在灰色的背景上，標本結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明暗差。 最后光束穿過第二個偏振裝置 (檢偏器 )，檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，使二者發(fā)生干涉。 在物鏡的后焦面處安裝了第二個 Wollaston棱鏡(滑行器 )，把兩束光波合并成一束。聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。 偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。 在顯微鏡載物臺上加一個微量步進馬達，使載物臺上下移動，改變焦平面，不同層次的光切面圖像經(jīng)計算機圖像三維重組，就能獲得樣品的立體結(jié)構(gòu)圖像。 七、偏 光 顯 微 鏡 偏光顯微鏡的結(jié)構(gòu) 激光掃描共聚焦顯微鏡原理圖 八、激光掃描共聚焦顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡實物圖 1. 激光掃描共聚焦顯微鏡工作原理 激光掃描共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像的基礎(chǔ)上裝有激光掃描裝置，以單色激光作為光源，使樣品被激發(fā)出熒光，利用計算機進行圖像處理，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。當(dāng)載物臺無樣品時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線。即光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。 利用它可以清楚地觀察到纖維絲、紡錘體、膠原、染色體、卵巢、骨骼、毛發(fā)、活細胞的結(jié)晶或液晶態(tài)的內(nèi)含物、神經(jīng)纖維、肌肉纖維、植物纖維等的細微結(jié)構(gòu)，從而可以分析細胞、組織的變化過程。因此，可以使用紫外光顯微鏡（ ultraviolet microscope）研究單個細胞的組成與變化情況。 暗視野照明方式 六、紫 外 光 顯 微 鏡 使用紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對于生物樣品使用紫外光照明還具有獨特的效果。 倒置顯微鏡 五、暗 場 顯 微 鏡 暗視野顯微鏡（ dark field microscope）的聚光鏡中央有檔光片，使照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 如相板的環(huán)形區(qū)使直射光滯后 1/4λ，加上開始直射光超前的 1/4λ，兩者相抵直射光不發(fā)生變化，直射光和偏折光無相位變化，形成的合成波振幅增加，產(chǎn)生明反差。兩組光在平面上成像。 三、相 襯 顯 微 鏡 相襯顯微鏡照明原理 光通過標本致密區(qū)時發(fā)生衍射，產(chǎn)生偏折光，相位和未受影響的直射光相比被推遲了 1/4λ。 活細胞和未染色的標本由于光的波長和振幅不發(fā)生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應(yīng)把透過標本不同區(qū)域的光波光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對比。 誘發(fā)熒光：一些細胞成分本身經(jīng)紫外線照射后不發(fā)熒光，但用熒光染料（酸性品紅、甲基綠、吖叮橙等熒光色素）進行活體染色或固定后切片染色，就能在熒光鏡下看見熒光，這種熒光叫誘發(fā)熒光。 熒光（ Fluorescence）： 細胞中的某些物質(zhì)（如葉綠素）經(jīng)紫外線照射后能發(fā)出可見光線，稱為熒光。利用它可研究熒光物質(zhì)在組織和細胞內(nèi)的分布。來自物鏡的光線經(jīng)棱鏡組分光成兩束平行光束，進入目鏡，雙目顯微鏡必須滿足分光后兩束光的光程必須相同和兩束光的光強度大小一致這兩個基本要求。 透 鏡 的 畸 變 (二 )、 色 差 色差 (chromatic aberration )是一種由白光或復(fù)色光經(jīng)透鏡成像時，會因各種色光存在著光程差而造成顏色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，從而造成像和物的較大失真。 如果離光軸越遠處放大率越大，則像的外部線段將比中間線段長，結(jié)果形成了枕形畸變，這種畸變稱為正畸變。 5．畸 變 (distortion) 由于像平面上各處放大率不同引起的成像缺陷稱為畸變 。 一般來說，透鏡像散隨透鏡形狀、光闌位置而異，可以用正、負透鏡適當(dāng)組合而消除。于是在成像平面上便形成一個頂端小而亮，遠離光軸方向形成逐漸增寬且亮度減弱的模糊尾部，形如彗星，稱為彗差。 2．彗 差 (broom aberration) 近光軸外的點光源發(fā)出的光束，經(jīng)過透鏡中央和邊緣部分后在垂直于光軸的同一成像平面上也不能交于同一個像點。 1．球 差 ( spheric aberration ) 透鏡的球差 光軸上的點光源所發(fā)出的光錐入射到透鏡的球折射面時，由于通過透鏡邊緣的光線不滿足近軸光線的條件，因此不能和通過近軸曲面的光線會聚成一個理想的亮點，而是形成一個中間亮邊緣逐漸模糊的彌散斑，這就是透鏡的球面像差，簡稱為球差。 一般情況下，物鏡的數(shù)值孔徑赿大，其工作距離赿小。 鏡像清晰度是指圖像的輪廓清晰、襯度適中的程度。 (六 ) 鏡 像 亮 度 和 清 晰 度 鏡像亮度即顯微鏡的圖像亮度的簡稱。 (五 ) 景 深 與 焦 長 景深 (depth of field)又稱焦點深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不變，景物沿光軸前后移動的距離稱“景深”。 （ 2）用短波長的光照射 如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。 NA=nsinβ 最高數(shù)值孔徑 油浸物鏡 較高數(shù)值孔徑 干物鏡 低數(shù)值孔徑 干物鏡 油 油 (二 ) 數(shù) 值 孔 徑 ? 分辨率：顯微鏡的最重要參數(shù)，能夠區(qū)分開兩個質(zhì)點的最小距離。 M=maq M是顯微鏡的總放大倍數(shù)； m是物鏡的放大倍數(shù)； a是目鏡的放大倍率，一般表達為明視距離 (正常視力者為 25cm)與目鏡焦