【正文】 能減少了反向循環(huán)至細(xì)胞表面的率，與通過(guò)融合伴侶引起的結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的未改性hTf相比，因此，融合蛋白可能潛在內(nèi)化后的一長(zhǎng)段時(shí)間內(nèi)保留在細(xì)胞內(nèi)。一個(gè)是融合蛋白并不影響植物源性rhTf內(nèi)化進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力。ELISA法證明，植物源性rhTfGLP1或rhTfGLP1x10孵育的希拉細(xì)胞裂解物上清液，與相同濃度的植物源性rhTf或商業(yè)性分離型hTf標(biāo)準(zhǔn)孵育的希拉細(xì)胞裂解上清液中的內(nèi)化蛋白相比，含有相似或更高水平的內(nèi)化重組融合蛋白（圖8）。整體型hTf在生理PH下比分離型hTf有更高的hTf受體親和力。植物源性整體型rhTf或商業(yè)性整體型hTf的內(nèi)化效能比分離型的要高。 Baiet al., 2005）。Keefe和Draper（1985）報(bào)道hTf結(jié)合蛋白白喉毒素對(duì)于培養(yǎng)的胸苷激酶缺乏的鼠L（LMTK）細(xì)胞是高細(xì)胞毒性的，與單純的白喉毒素相比敏感性改了大約10000倍。作為藥物送遞系統(tǒng)的hTf，提供了幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括hTf結(jié)合蛋白質(zhì)藥物的高效率轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞，和延長(zhǎng)血清半衰期和提高結(jié)合蛋白的治療療效。這個(gè)過(guò)程涉及了兩個(gè)截然不同的步驟，包含hTf結(jié)合至細(xì)胞表面受體和隨后的hTf內(nèi)化。這可能是由于血清中仍然存在細(xì)胞生長(zhǎng)需要的多種不同生長(zhǎng)因素的原因（Barnes, 1987）。 AlvarezHernandez et al., 1998）。與分離型相比，整體型植物源性rhTf或者商業(yè)性rhTf標(biāo)準(zhǔn)有更有效的生長(zhǎng)刺激效果，表明細(xì)胞生長(zhǎng)中鐵的重要性和hTf在轉(zhuǎn)運(yùn)鐵進(jìn)入細(xì)胞的作用。我們的數(shù)據(jù)顯示植物源性rhTf能夠刺激以劑量依賴(lài)方式培養(yǎng)在SFM培養(yǎng)基中的HeLa細(xì)胞或鼠腎小管上皮細(xì)胞的能力，即使不比商業(yè)hTf好，也是令人鼓舞人心的等同作用（圖5a、b，圖6）。雖然結(jié)果令人振奮，但是酵母菌源性rhTf可能受生產(chǎn)量和費(fèi)用的限制。近來(lái)，DeltaFerrinTM，一種酵母菌源性的不含動(dòng)物成分的rhTf已由Dwltw Biotechnology （Nottingham,.），在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)基SFM中用做鐵螯合劑。然而，重組胰島素普遍用作SFM培養(yǎng)基的添加物，用于SFM的轉(zhuǎn)鐵蛋白一般是動(dòng)物源性的，導(dǎo)致與動(dòng)物源性成分相關(guān)的安全憂(yōu)慮。向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入最普通的非血清成分有生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素（Barnes, 1987。從工業(yè)角度而言，SFM在減少或消除動(dòng)物源性成分的使用上非常重要的（Castle and Robertson, 1999），因此避免細(xì)菌、病毒、支原體污染。 Wally and Buchanan, 2007）。 Finkelstein et al., 1983）。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)鐵飽和度完全破壞了轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白的抑制作用，使得許多微生物能再生（Lankford, 1973。通過(guò)在培養(yǎng)基中隔絕鐵，hTf使微生物得不到鐵。長(zhǎng)期抑制細(xì)菌生長(zhǎng)性能的缺乏，可能反映了培養(yǎng)基中有鐵存在時(shí)，植物源性分離型rhTf或標(biāo)準(zhǔn)分離型hTf的可能的飽和度。植物源性rhTf表現(xiàn)出了劑量依賴(lài)性的抑菌效能，與商業(yè)性分離型hTf標(biāo)準(zhǔn)類(lèi)似。我們的研究表明進(jìn)一步表明，糖類(lèi)在hTf的生物活性上沒(méi)有起到多大作用。Mason et al.（1993）比較了幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞源性糖基化rhTf和非糖基化突變型rhTf的受體結(jié)合力，得出結(jié)論：結(jié)合在希拉S3細(xì)胞的非糖基化突變型rhTf的結(jié)合方式與其他三種有相同活性的hTf對(duì)照試樣和與程度相同的糖基化rhTf相同。Miletich和Broze（1990）證實(shí)占據(jù)蛋白C非標(biāo)準(zhǔn)AsnXCys序列的部分糖基化位點(diǎn)可能是通過(guò)二硫鍵形成而導(dǎo)致位點(diǎn)阻塞。因?yàn)閔Tf包含多達(dá)19種分子內(nèi)雙硫鍵，雙硫鍵形成的優(yōu)勢(shì)性過(guò)程可使得植物源性rhTf上形成N鏈糖基化的時(shí)間大大縮短。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)折疊常通過(guò)二硫化鍵形成而完成，形成的雙硫鍵有效窗口影響了特定蛋白N鏈糖基化的效能。在真核細(xì)胞，N鏈的糖基化常共翻譯地出現(xiàn)。去糖基化分析的結(jié)果顯示植物源性rhTf是非糖基化的（圖3）。人血清Tf是在其羧基末端區(qū)Asn413和Asn611包含兩個(gè)潛在N鏈接糖基化位點(diǎn)的一種糖蛋白，碳水化合物構(gòu)成了其大約5%的分子量（Spik et al., 1975。此外，C末端KDEL的結(jié)合有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位，促進(jìn)蛋白質(zhì)的高水平積累（Ma et al., 2005。UTL序列，使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)目標(biāo)信號(hào)KDEL使rhTf進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER腔的目標(biāo)。直接ELISA顯示，%（）。為達(dá)到此目標(biāo)，生產(chǎn)出攜帶本構(gòu)體CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的hTf基因的轉(zhuǎn)基因低生物堿、無(wú)尼古丁煙草。近來(lái)制取rhTf的方法證明是困難和效率地下的。 Bai et al., 2005）。 de Vries et al., 2004。hTf的多功能性，使其在多種不同的應(yīng)用中相當(dāng)有用，尤其是在作為治療人類(lèi)轉(zhuǎn)鐵蛋白缺乏癥、IR損傷、感染轉(zhuǎn)移和心血管疾病的藥物，也可作為一種新功能——有效的特種癌細(xì)胞藥物送遞或靶向口腔給藥的載體系統(tǒng)（Hayashi et al., 1993。利用抗hTf抗體對(duì)相同裂解物上清液進(jìn)行免疫蛋白印跡分析證明了預(yù)期大小融合蛋白的存在（圖8b）。如圖8a示，Hispurified的植物源性rhTfGLP1或rhTfGLP1x10（分離型）孵育的希拉細(xì)胞裂解物上清液中包含的融合蛋白，與植物源性分離型rhTf或商業(yè)性分離型rhTf控制組孵育的希拉細(xì)胞裂解物上清液中包含的融合蛋白相比，水平略微升高或近似，這表明融合蛋白不干擾hTf內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞的能力。植物源性rhTfGLP1和rhTfGLP1x10分子量分別大約為79和110kDa（圖2b）。為達(dá)到此目的，我們?cè)谥参镏辛硗猱a(chǎn)生了兩個(gè)融合蛋白——rhTfGLP1和rhTfGLP1x10——并首先探究是否植物源性rhTf融合蛋白能內(nèi)化進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，如體外希拉細(xì)胞。圖7b表明抗rhTf抗體對(duì)預(yù)期大小的hTf的蛋白帶有特別反應(yīng)，表明植物源性rhTf在希拉細(xì)胞中仍保持相當(dāng)穩(wěn)定。與分離型相比，整體型植物源性rhTf或商業(yè)性hTf更容易被體外希拉細(xì)胞吸收（圖7a）。此外，內(nèi)化的hTf量與添加入希拉細(xì)胞培養(yǎng)基中的hTf量很相關(guān)。如圖7a示，在離心分離植物源性rhTf刺激的希拉細(xì)胞并移除細(xì)胞裂片之后，rhTf可以很容易地在上層裂解液中發(fā)現(xiàn)。為了驗(yàn)證植物源性rhTf是否內(nèi)化入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，Hispurified的植物源性rhTf孵育的希拉細(xì)胞，經(jīng)過(guò)乙酸/生理鹽水溶液處理以去除細(xì)胞表面植物源性rhTf。內(nèi)化的hTf與細(xì)胞表面hTf，可以通過(guò)細(xì)胞裂解之前使用乙酸/生理鹽水溶液初步處理細(xì)胞而辨別（Haigler et al., 1980。為了進(jìn)一步描述植物源性rhTf的生物活性，用希拉細(xì)胞系，在體外分析了植物源性rhTf內(nèi)化進(jìn)入活體哺乳動(dòng)物活體細(xì)胞的能力。低濃度（2ug/mL）的植物源性rhTf或商業(yè)性hTf，各自對(duì)[3H]胸腺嘧啶細(xì)胞提取物出現(xiàn)輕微影響（數(shù)據(jù)未顯示），表明了劑量依賴(lài)性反應(yīng)。沒(méi)有轉(zhuǎn)鐵蛋白的無(wú)血清K1培養(yǎng)基中細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有或很少[3H]胸腺嘧啶提取物。通過(guò)測(cè)量[3H]，來(lái)評(píng)估植物源性rhTf的刺激效應(yīng)。更低濃度（2ug/mL）的植物源性rhTf，如商業(yè)性hTf，在刺激HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)中仍表現(xiàn)出顯著影響效果，整體型比分離型表現(xiàn)出更好的刺激效應(yīng)（圖5b）。座位正控制組，添加了10%（v/v）胎牛血清FBS的SFF12培養(yǎng)基獲得了最高的活細(xì)胞計(jì)數(shù)，在培養(yǎng)第4天后活細(xì)胞數(shù)目增加了20多倍?；罴?xì)胞數(shù)目的增加率，與使用了商業(yè)性整體型hTf標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基中觀(guān)察到的相比，即使不好，也是相似的。加了濃度20ug/mL的Hispurified的植物源性整體型rhTf的無(wú)血清SFF12培養(yǎng)基明顯地在體外刺激了HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖5）。此外，hTf是無(wú)血清培養(yǎng)基中大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的長(zhǎng)期生存必需的（Barnes and Sato, 1980a,b）。植物源性rhTf刺激哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)研究證實(shí)轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)體外細(xì)胞增殖有深遠(yuǎn)影響（Barnes and Sato, 1980a,b。添加了低濃度（50ug/mL）的植物源性分離型rhTf、商業(yè)性分離型hTf也表現(xiàn)出了對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的抑制作用，但與控制組相比沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)性差異（數(shù)據(jù)未顯示）。正如圖4示，包含100ug/mL植物源性rhTf（分離型rhTf）或分離型hTf標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基中，與單獨(dú)培養(yǎng)基或添加來(lái)自野生型81V9的植物蛋白的控制培養(yǎng)基相比，不能完全抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，但是能夠顯著地推遲919h接種（P）。 Giaettiet al., 1999）。植物源性rhTf抑制細(xì)菌生長(zhǎng)植物源性rhTf的生物活性通過(guò)其抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)而評(píng)估。非相關(guān)的卵清蛋白顯示，在有或沒(méi)有鐵時(shí)A465/A280率沒(méi)有變化。有鐵存在時(shí)，與整體的hTf標(biāo)準(zhǔn)相似，但是與卵清蛋白（OVA）相比有顯著不同（P）（表格1）。然而，分離的hTf和整體的hTf都具有生物活性，每一種都在465280nm存在典型的吸光率，（Huebers et al.,1981）。植物源性rhTf保持其體外可逆地結(jié)合鐵的能力因?yàn)閔Tf的主要功能包括裹鐵和隨后的運(yùn)輸，植物源性rhTf以體外隔離鐵的能力為特征。 Wang et al., 2008），這也進(jìn)一步被其他人證實(shí)（Menassa et al., 2001。然而，植物源性rhTf分子量的提高不可能是因?yàn)橹参镌葱詒hTf的信號(hào)肽序列