乳鐵蛋白結(jié)合聚乙二醇聚乳酸納米粒腦內(nèi)遞藥特性doc-文庫吧資料
2024-07-30 16:00本頁面
【正文】 通過測(cè)定香豆素6在血和腦中的濃度評(píng)價(jià)兩種納米粒在血和腦中的分布，結(jié)果表明，兩種納米粒在腦內(nèi)的藥時(shí)曲線相似，約在1h時(shí)達(dá)峰（圖6），LfNP腦內(nèi)的AUC(0–t)。這說明LfNP通過不同于NP的機(jī)理轉(zhuǎn)運(yùn)入腦。m.A/I NP incubation for h；D/L LfNP incubation for h；B/J NP incubation for 1 h；E/M LfNP incubation for 1 h；C/K NP incubation for 2 h；F/N LfNP incubation for 2 h圖4 NP, Lf–NP和Lf 的體外毒性評(píng)價(jià)，n=3Fig. 4 In vitro cytotoxicity of NP, Lf–NP and Lf on cells at concentrations ranging from to 3 mg/ml. Data represented the mean 177。C. The magnification bar is 100 181。m，其余標(biāo)尺為100 181。C incubation for 30 min 圖3 37 186。C incubation for different time。C incubation for 1h, respectively。C孵育30 min后的攝取情況Fig. 2 uptake quantitative results, n=3 *p＜ A 160 μg/ml Lf–NP and NP at 37 186。C孵育1h后的攝取情況；B10 μg/ml Lf–NP和NP在37 186。圖2 ， n=3，*p＜A160 μg/ml Lf–NP和NP分別在 37 186。2h后，LfNP廣泛分布在整個(gè)細(xì)胞且進(jìn)入細(xì)胞核（圖3H）而NP則主要分布于胞漿。由熒光顯微鏡照片可看出，在37 186。LfNP的攝取量高于NP，提示由于Lf的引入LfNP可能存在不同于NP的內(nèi)吞機(jī)理。4 ℃時(shí)，兩種納米粒的攝取很快達(dá)到飽和，未見有顯著差異。37 186。C的攝取量均高于4 186。 E NP stained with antiLf primary antibody and 10nm colloidal gold labeled rabbit antigoat IgG sequentially. LfNP腦內(nèi)遞藥特性和生物相容性的體外評(píng)價(jià)，各時(shí)間點(diǎn)LfNP的攝取量均高于NP。 C Lf–NP stained with antiLf primary antibody and 10nm colloidal gold labeled rabbit antigoat IgG sequentially。圖1納米粒的透射電子顯微鏡照片，標(biāo)尺均為100 nmANP；BLfNP；C加入抗Lf一抗和連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗后的LfNP；D僅加入連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗的LfNP；E加入抗Lf一抗和連接有10nm膠體金兔抗羊IgG二抗后的NPFig. 1 Transmission electron micrograph of different nanoparticles negatively stained with phosphotungstic acid solution. Bar on each photo was 100 nm.A NP。13）個(gè)Lf。%；透射電鏡下可以清楚的觀察到，LfNP表面標(biāo)記有黑色的膠體金顆粒（圖1C），而未加入山羊抗Lf抗體孵育的LfNP（圖1D）和NP表面（圖1E）未見膠體金顆粒，證實(shí)該納米粒表面連接有Lf。 ）nm和（ 177。以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將各樣品的峰面積比代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得腦組織及血樣中的藥物濃度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)采集3只小鼠樣品。 LfNP腦內(nèi)遞藥特性的體內(nèi)評(píng)價(jià)小鼠尾靜脈注射60 mg/kg載香豆素6的NP和LfNP， 1h后乙醚麻醉，心室灌注生理鹽水20 min，斷頭處死，取腦置4%多聚甲醛固定24h，蔗糖梯度脫水后于視交叉后1 cm處冠狀切腦組織，冰凍切片，厚度20 μm，PBS漂洗后用1 μg/ml DAPI染色10 min，PBS漂洗，用熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察納米粒在腦組織中的分布和熒光強(qiáng)度。用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)。104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜。用 1% TritonX 100 400 μl溶解細(xì)胞。加入10 μg/ml LfNP和過量Lf（10 mg/ml）37℃孵育30min進(jìn)行攝取抑制試驗(yàn)。將載有香豆素6的LfNP和NP稀釋成含1－60 μg/ml的納米粒供試液，按不同濃度每孔加入1 ml（空白孔加1 ml HBSS），分別放入37℃及4℃孵育1 h，考察細(xì)胞在4℃和37℃下對(duì)LfNP和NP的攝取情況。棄去納米粒溶液，細(xì)胞用PBS沖洗三次，取出玻片放入4%多聚甲醛中于室溫固定20 min，用PBS漂洗3次后，用熒光封片劑封片，用相差及熒光顯微鏡觀察。 LfNP腦內(nèi)遞藥特性和生物相容性的體外評(píng)價(jià) ，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1天。ELISA測(cè)定LfNP表面Lf個(gè)數(shù)。采用透射電鏡技術(shù)（TEM）和動(dòng)態(tài)光散射分析（DLS）對(duì)LfNP和NP的形態(tài)，粒徑進(jìn)行表征。巰基化Lf與NP常溫下反應(yīng)9h制得LfNP。2. 實(shí)驗(yàn)方法 NP和LfNP的制備及表征馬來酰亞胺基聚乙二醇聚乳酸和甲氧基聚乙二醇聚乳酸1：9混合以復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備NP [19]。1. 儀器和材料JY92II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；R200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和B490恒溫水?。˙uchi，德國(guó)）； NICOMPTM 380 ZLS粒度/zeta電位測(cè)定儀（NICOMP，美國(guó)）；PHI 5000C X射線光電子能譜儀（ESCA system，美國(guó)）；CM 120透射電鏡（Philip，荷蘭）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，中國(guó)香港）；UFXDX倒置相差顯微鏡（Nikon，日本）；UFXII熒光顯微鏡（Nikon，日本）；LC10A RF10AXL高效液相色譜儀（Shimadzu，日本）。此外，聚乙二醇和聚乳酸都是FDA已批準(zhǔn)的輔料，將使載藥系統(tǒng)具有較好的生物相容性和安全性[17，18]。本試驗(yàn)利用Lf的腦靶向能力構(gòu)建了受體介導(dǎo)的生物可降解腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)并探索了Lf作為腦靶向頭基的能力?，F(xiàn)已證明多種生物BBB表面均存在Lf受體（LfR），能夠介導(dǎo)Lf轉(zhuǎn)運(yùn)[1214]。乳鐵蛋白是一種陽離子鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族，它由690個(gè)氨基酸折疊而成兩個(gè)球形裂片，各包含一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)。然而，脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差及單克隆抗體效果的不穩(wěn)定限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[810]。在各種非侵入給藥方式中，利用在BBB上存在特異受體的靶向頭基連接載藥系統(tǒng)得到的受體介導(dǎo)的腦內(nèi)遞藥系統(tǒng)在具有腦靶向功能的同時(shí)能夠提高藥物包封率，降低副作用和避免多藥耐藥系統(tǒng)的外排，具有很好的前景[5]。局部侵入給藥（腦內(nèi)直接注射/滴注）易引發(fā)感染，手術(shù)費(fèi)用高且有效遞藥面積有限[3]。大約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物，包括酶，基因和siRNAs等均不能透過BBB[2]
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