【正文】 邊緣線上的細(xì)胞就不用統(tǒng)計(jì)了。如細(xì)胞密度太高，可稀釋后計(jì)數(shù)。2. 計(jì)數(shù)A： 用酒精棉將計(jì)數(shù)板與蓋玻片擦干凈；15 / 32B： 蓋玻片平穩(wěn)地蓋在計(jì)數(shù)板的中間，蓋玻片與計(jì)數(shù)板的邊緣相距 左右；C： 用移液槍取 20μl 左右細(xì)胞懸液，滴加到蓋玻片與計(jì)數(shù)板的邊緣空隙處，讓液體通過毛細(xì)管現(xiàn)象自然吸附進(jìn)蓋玻片下計(jì)數(shù)板的小室中；D： 顯微鏡下統(tǒng)計(jì) 4 個方格中的細(xì)胞數(shù)目，求平均值，即可得到細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度， （比如：四個方格中的細(xì)胞數(shù)分別是1117 和 14，平均為 16，那么細(xì)胞濃度為 16104=105個/ml） 。血球計(jì)數(shù)板上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1mm2=104ml。例如，取 明膠加入 100ml 雙蒸水中，60℃左右水浴加熱溶解，高壓滅菌，4℃保存。具體操作：① 將玻璃培養(yǎng)瓶高壓滅菌；② 加入明膠或多聚 D 型賴氨酸，37℃孵箱放置 30min 以上；③ 回收明膠或多聚賴氨酸；④ 將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中。C： 對于貼壁細(xì)胞，消化吹打成細(xì)胞懸液時，也可先將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，倒掉上清液，加新培養(yǎng)基吹打成懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后再分配。注意：A： 不應(yīng)待細(xì)胞長得特別滿的情況下，消化細(xì)胞，因?yàn)檫@時細(xì)胞的活力并非最好。 （吹打不宜過猛，避免過多的泡沫形成）F： 吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，吸取合適數(shù)量的細(xì)胞懸液，至新培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)足培養(yǎng)基（50 ml 培養(yǎng)瓶可加 45 ml 培養(yǎng)基） 。4. 細(xì)胞消化傳代貼壁細(xì)胞一般采用消化傳代法；部分貼壁生長細(xì)胞（半貼壁細(xì)胞）可直13 / 32接吹打即可傳代；懸浮細(xì)胞可采用直接吹打或離心后傳代。1) 貼壁細(xì)胞D： 倒掉舊的培養(yǎng)基；E： 用 PBS 清洗：加入 PBS，輕輕搖蕩，倒掉（這步并非必須的，視細(xì)胞生長情況而定，一般在消化傳代后第一次換液時，最好用PBS 清洗） ；F： 加入新的培養(yǎng)基（一般中小號培養(yǎng)瓶，4~6ml 左右） 。同時也可以根據(jù)培養(yǎng)基的顏色進(jìn)行判斷。3. 細(xì)胞換液細(xì)胞何時換液，依賴于細(xì)胞生長速度、細(xì)胞密度等。具體選擇什么樣的血清及血清的濃度，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞生長的特點(diǎn)而定，有些細(xì)胞可能需要胎牛血清，而有些細(xì)胞特別是轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，對于血清的需要量是很低的，在 %左右。 以下為檸檬黃 為黃色 為橙色 為紅色 為酚紅 為紫色12 / 322. 血清的使用 血清可以提供細(xì)胞生長所必需的生長因子和營養(yǎng)元素。這兩大類細(xì)胞在細(xì)胞換液與傳代時的方式截然不同。細(xì)胞形態(tài)的觀察可以先參考一些資料，比如 ATCC 網(wǎng)站上或一些文獻(xiàn)中的照片。6) 定容至 1L，過濾除菌，分裝，4℃保存。4) 加水至 800ml 左右，攪拌約 3h，加入雙抗（青霉素 100U/ml，鏈霉素 100μg/ml）及 NaHCO3（ DMEM， g RPMI1640， MEM， g M199）等，繼續(xù)攪拌 1h。2) 取 1L 的錐形瓶，洗凈，放入攪拌子，倒入約 300ml 的雙蒸水，開啟攪拌器攪拌。每種細(xì)胞具體用什么培養(yǎng)基，請參考文獻(xiàn)或 ATCC 網(wǎng)站（ .） 。5. 培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基是維持體外細(xì)胞生存和生長的基本溶液，是組織細(xì)胞培養(yǎng)最重要的條件。注意：一般情況下，后一種消化液的消化能力要強(qiáng)于前一種。1) %胰蛋白酶消化液（100ml）A： 稱取 的胰蛋白酶；B： 加入 PBS 液 100ml；C： 磁力攪拌，使其完全溶解（一般攪拌 1h 以上） ；D： 過濾除菌，4℃保存。具體采用什么消化液，操作者應(yīng)根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)情況，相應(yīng)調(diào)整胰蛋白酶的濃度，比如在進(jìn)行人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）原代分離時，采用的是 %的胰蛋白酶消化液。4. 胰蛋白酶消化液配制：在進(jìn)行原代培養(yǎng)過程中需分散組織、細(xì)胞，在傳代中要使細(xì)胞脫離附著的底物時均常使用消化液。10 / 32D： 定容至 1L。B： 用小體積（2ml 左右）溶解 CaCl2，為 B 液。保存：過濾除菌，4℃保存。D： 定容至 1L。B： 用小體積（2ml 左右）溶解 CaCl2，為 B 液。9 / 322. Hank’s 配制（1L）：NaCl 8 gNa2HPO4用途：1) 配制 EDTA、胰酶、膠原酶；2) 沖洗組織和細(xì)胞。1. PBS 配制（1L）：NaCl 8 gNa2HPO4目前，在細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程中，我們經(jīng)常會用到一些緩沖有磷酸鹽緩沖液（PBS） ， Hank’s，DHank’s，KRPH ，HBSS 等緩沖液。不管那種方法，我們采用的濾膜均為 孔徑的濾膜。本實(shí)驗(yàn)室中主要采用抽濾式裝置和針孔注射式濾器兩種方法。同時，紫外線消毒也是我們常用于塑料培養(yǎng)皿（塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等）的消毒。⑥ 避免物質(zhì)沉淀、變色及分解：葡萄糖不能和含有氨基酸或磷酸鹽的組分一起滅菌；磷酸鹽不能和含有氨基酸或者其他礦物質(zhì)鹽溶液（Ca 2+）一起滅菌；含有礦物質(zhì)鹽的溶液不能和瓊脂一起滅菌；不要在 一下滅菌瓊脂溶液。④ 含有去垢劑的緩沖液，如 10% SDS，會因?yàn)榉序v而溢出。② 哺乳動物、植物和昆蟲的培養(yǎng)基。⑤ 針式濾器及過濾裝置，在進(jìn)行高壓滅菌時，要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，濾膜光滑一面是正面，否則起不到過濾的作用。滅菌完后，應(yīng)立即擰緊瓶塞或拔掉針頭（多時須貼上膠布） 。 （水量與小爪齊平）② 滅菌時，各包裹不宜過大過緊，各包裹間要有間隙，使蒸汽能對流易滲透到包裹中央。如果突然開蓋，冷空氣大量進(jìn)入，蒸汽凝成水滴，使物品潮濕，且玻璃類易發(fā)生爆裂。⑤ 滅菌完后，應(yīng)先關(guān)掉滅菌鍋的開關(guān)，拔掉電源插頭，再將變壓器調(diào)零。③ 打開放氣閥，調(diào)節(jié)變壓器至 220V，開始加熱。1) 操作方法 如下：① 滅菌前，應(yīng)檢查滅菌鍋中的水量，保持水位高于加熱圈 2cm 左右。高壓蒸汽滅菌法就是利用高壓和高熱釋放的潛熱進(jìn)行滅菌。1. 濕熱消毒（121 度，30 分鐘）常用且很有效的消毒方法，一般使用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行。防止培養(yǎng)物污染主要通過培養(yǎng)用品的消毒滅菌與實(shí)驗(yàn)人員的無菌操作技術(shù)來完成。第 4 節(jié) 培養(yǎng)用品的消毒滅菌及滅菌鍋的使用造成組織細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因之一是發(fā)生污染，特別是微生物污染。B. 從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。75％酒精浸泡過夜，超凈臺中吹干，紫外照射后使用即可。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓滅菌。2) 新膠塞烘干后用 2％氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘（用過的膠塞只要用6 / 32沸水處理 30 分鐘） ，自來水洗凈，烘干。1) 針式濾器帽不能泡酸液：用 NaOH 泡 612 小時，或者煮沸 20 分鐘（指新的濾器） 。3) 烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝，待用。4) 定期檢查孵箱中水盤中的水量及是否污染（最好每周更換一次，用無菌水）第 3 節(jié) 培養(yǎng)用品的清洗1. 玻璃器皿的清洗1) 自來水或肥皂水刷洗。灼燒一下瓶口和移液管等，使顆粒固定在表面和制造一個向上的氣流，以減少掉落顆粒的數(shù)量。4. 其他注意事項(xiàng)1) 保持試劑瓶與桌面成約 45℃時打開蓋子或移取液體：這樣可以盡量減少空氣的污染以及在移液時產(chǎn)生最少的氣溶膠。5 / 328) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，依次將個人物品帶出超凈臺（包括廢液缸） ，用酒精棉擦拭桌面，熄滅酒精燈，最后調(diào)小風(fēng)力并關(guān)掉日光燈。7) 打開的瓶子，應(yīng)放在酒精燈火焰旁，瓶蓋反放朝上。5) 帶入操作臺中的物品，應(yīng)注意：剛經(jīng)高壓滅菌的可以直接放入超凈臺中；臨時帶進(jìn)來的，應(yīng)先用 75%酒精擦拭或噴灑后再放入超凈臺，這類物品包括各種裝培養(yǎng)基、緩沖鹽等的瓶子、試管架、膠塞等。4) 操作時應(yīng)盡量減少手臂的運(yùn)動，盡可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和試劑盡可能放在手邊，以酒精燈為界，左手用的東西放在酒精燈的左邊，右手用的東西放在右邊。3) 實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)清除無菌區(qū)與有菌區(qū)的概念。3. 操作臺中的無菌操作1) 在超凈臺經(jīng)紫外照射滅菌后，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)注意在通風(fēng)條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。2) 穿好實(shí)驗(yàn)服，更換拖鞋。4) 每天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時清理垃圾筒中垃圾。2) 培養(yǎng)箱定期滅菌：用 75%酒精擦拭孵箱內(nèi)部（最好同時將孵箱中各隔層4 / 32拆下） ，再用紫外燈照射。2. 細(xì)胞房中常見耗材與設(shè)備 超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、倒置顯微鏡、普通冰箱（4℃，20℃） 。 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25mm 2，75mm 2 ，175mm 2） 、細(xì)胞培養(yǎng)板（96well ，24well，12well ，6well） 、細(xì)胞培養(yǎng)皿（35mm，60mm ） 、細(xì)胞凍存管（2ml，5ml） 、離心管（10ml） 、移液管（2ml，5ml，10ml） 。中藥復(fù)方研究室細(xì)胞與分子實(shí)驗(yàn)操作指南（）2 / 32目 錄第一章 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)常用耗材與設(shè)備 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????3第二節(jié) 無菌操作 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3第三節(jié) 培養(yǎng)用品的清洗 ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????5第四節(jié) 培養(yǎng)用品的消毒滅菌及滅菌鍋的使用 ????????????????????????????????????????????????