【正文】 of DMSO，并用 DMSO 以 1： 100 的比例稀釋成 10umol/l 工作液。 4．辣根過氧化物酶（ HRP） (VI 型， 310 IU/mg 蛋白 )： 5 mg (1550 IU)溶于 1 ml KRM。 2．不含酚紅的 KrebsRinger 培養(yǎng)液（ KRM）：見附錄 4， A 小節(jié)。因此含少量的白細(xì)胞就會對精子懸液產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號產(chǎn)生重要影響。 (Zorn et al., 2020。 由于人精子表面沒有 FMLP 受體，由白細(xì)胞特異探針 formylmethionylleucylphenylalanine (FMLP)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號對白細(xì)胞群是特異的，并且可以用含有已知數(shù)量的多形核白細(xì)胞懸液校正。然而，也可以用其它探針（如 lucigenin）來檢測洗滌后的人精子產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)（ ROS）（ Aitken et al., 1992。 精子懸液產(chǎn)生的活性氧類物質(zhì)的測定 原理 此程序需要使用一個靈敏的照度計來檢測存在化學(xué)發(fā)光探針，如魯米諾或 lucigenin 時精子產(chǎn)生的少量的光。這樣含量測定的結(jié)果與精子脂質(zhì)過氧化的狀態(tài)密切相關(guān)。生成高濃度的 ROS 可能引起過氧化損害和精子功能喪失，也可能引起細(xì)胞核與線粒體基因組的 DNA 的損害 (Sawyer et al., 2020)。 Smith et al., 1996)。 West, 1990)產(chǎn)生的。 Iwasaki amp。 Clarkson, 1987。(Agarwal et al., 2020)。許多細(xì)胞具有酶 性抗氧化劑系統(tǒng)（超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過氧化酶和過氧化氫酶）或非酶性抗氧化劑系統(tǒng)（尿酸、維生素 C、維生素 E）。 Aitken et al., 2020。 (Griveau amp。 活性氧類物質(zhì)是氧的代謝產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過氧化氫、氫氧根、過氧化氫根和一氧化氮。 Gomez et al., 1996。 活性氧類物質(zhì) 前言 中段帶有多殘留細(xì)胞質(zhì)的異常精子會產(chǎn)生過多的活性氧類物質(zhì) (ROS)，并且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在高活性的細(xì)胞質(zhì)酶，如肌酸磷酸激酶。 我們在信號傳導(dǎo)路徑調(diào)節(jié)精子功能方面認(rèn)識的進(jìn)展，同樣也將促進(jìn)相關(guān)診斷性實(shí)驗(yàn)的發(fā)展，這在不育男性精子的檢測中是有缺陷的。 Krausz, 2020。 (Sakkas et al., 1998。例如，近期的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)細(xì)胞核中 DNA 致密性和完整性在確定人類精子功能活性方面的重要性。 （沈陽菁華醫(yī)院 許蓬譯） 第 4 章 研究精子功能所用檢測方法 當(dāng)實(shí)施精子功能檢驗(yàn)時，在射精 1 個小時之內(nèi)將精子從精漿中分離出去，以限制非精子細(xì)胞對精子的損害是至關(guān)重要的。很多大樣本生育力結(jié)果的研究要求精制 CASA應(yīng)用程序 以檢測精子形態(tài)。 Garrett 等 (2020)發(fā)現(xiàn)精液中具有與透明帶結(jié)合（ Z%）的頭部形態(tài)特征的精子所占的百分比及直線速度（ VSL），與大樣本的低生育力夫婦的自然妊娠率是有顯著且獨(dú)立的關(guān)系。 兩個研究已經(jīng)提示在 CASMA 結(jié)果與生育力之間存在顯著聯(lián)系。如果精子密度低（ 2 106/ml），需要離心濃縮標(biāo)本，如 小節(jié)所述。 與人工形態(tài)學(xué)評價一樣，程序和儀器必須標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制，確保結(jié)果可比較、可信。自動化評價的本質(zhì)意味著存在制備缺陷和人為影響時沒有補(bǔ)救方法。 Menkveld et al., 1997)；正確的將精子頭與精液碎片區(qū)分開存在技術(shù)上的困難，尤其在精子 濃度低時 (Garrett Baker,1995； Menkveld et al., 1997。 Baker, 1995)，這優(yōu)于有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員的手動評估。 與人工系統(tǒng)相比，自動化系統(tǒng)更具客觀性，精確度和重復(fù)性的潛力 (Menkveld et al., 1990)。然而，精子尾部缺陷對運(yùn)動的影響可以更直接地通過應(yīng)用 CASA 檢測活動力和運(yùn)動狀態(tài)。 計算機(jī)輔助精子形態(tài)學(xué)評估 圖像分析在評價精子形態(tài)方面，可能帶來量化、客觀性和可重復(fù)性的重大進(jìn)展。 注釋： CASA 儀器檢測并計數(shù)熒光染色精子的頭部。 可檢測的精子密度為 2 106/ml50 10６ /ml 之間 (Garrett et al., 2020)。例如，如果使用一次性計數(shù)池，因?yàn)榫映錆M計數(shù)池時分布會不均勻，故評估不同位置的精子標(biāo)本是重要的 (DouglasHamilton et al., 2020b)。目前所有儀器交叉測量結(jié)果的可比程度尚屬未知。精子頭沿其曲線軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時間平均絕對值。精子曲線軌跡越過其平均路徑軌跡的時間平均速率。 VSL/VAP。 STR=前向性。精子頭沿其實(shí)際軌跡的空間平均路徑擺動的尺度。 VSL/VCL。 LIN=直線性。以側(cè)擺的最大值或平均數(shù)值表示。m)。這個軌跡是根據(jù) CASA 儀器中的算法對實(shí)際軌跡平整后計算出來的；這些算法因儀器不同而有所不同，故不同 CASA 系統(tǒng)的數(shù)值不能直接相比較。m/s)。根據(jù)精子頭在開始檢測時的位置與最后所處位置之間的直線運(yùn)動的時間平均速度。 VSL=直線速度 (181。精子頭沿其實(shí)際的曲線，即在顯微鏡下見到的二維方式運(yùn)動軌跡的平均速度。 VCL=曲線速度 (181。但追蹤精子的時間至少是 1 秒，足以得到基本 CASA 檢測精液的可靠結(jié)果 (Mortimer, 1994b)。分析錄像（錄像帶、 CDROM 或 DVD）記錄的結(jié)果可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，并 按質(zhì)量保證程序進(jìn)行（見附錄 7， 小節(jié)）廠家將對錄像機(jī)的選擇以及使精子頭和背景產(chǎn)生最大反差的最適照明條件提出建議。使用原理相同的質(zhì)量控制，使活動力的評估標(biāo)準(zhǔn)化（見 ）。必須檢測幾個有代表性的視野：每個計數(shù)板檢測 6 個視野（共 12 個視野）以得到可靠的結(jié)果。m 深的計數(shù)池可以得到可靠的結(jié)果。 用無精子的精漿稀釋原精液樣本至其密度低于 50 106/ml。在這種情況下，建議稀釋標(biāo)本，而同源精漿更適合。檢測精子活動力，標(biāo)本密度應(yīng)控制在 2 106/ml 到 50 106/ml 之間 (Garrett et al., 2020)。 CASA 系統(tǒng)必須將樣本保持在 37℃，因?yàn)榫舆\(yùn)動參數(shù)具有溫度敏感性。 ESHRE, 1998)。 Katz, 1992。制造商提供了適宜的參數(shù)，但使用者必須檢查每個設(shè)備的運(yùn)行是否達(dá)到其所要求的重復(fù)性和可靠性。有必要在進(jìn)行一定統(tǒng)計學(xué)分析之前只對單一精子參數(shù)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換。 CASA 儀器應(yīng)與可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析的計算機(jī)軟件結(jié)合起來。如果想把精子按運(yùn)動能力分類或在一份標(biāo)本中做變異性的其它分析，至少需要追蹤 200 個，如果可能最好 400個活動精子。 用 CASA 分析精子運(yùn)動參數(shù)時，每個標(biāo)本中至少追蹤 200 個活動精子。 Katz, 1992)。 Kraemer et al., 1998)。 Katz, 1992?；盍Π俜直鹊墓烙嬛凳遣豢尚诺?，因?yàn)檫@個數(shù)值是在計算不活動的精子數(shù)目的基礎(chǔ)上得出的，而一些顆粒碎片也可能被混淆其中。利用 CASA 來檢測精液活動力和密度的方法分別在 和 小節(jié)中介紹，而 小節(jié)則闡述了計算機(jī)輔助形態(tài)學(xué)分析的相關(guān)問題。 Garrett et al., 2020。 Donnelly et al., 998。 Irvine et al., 1994。 一些研究提示， CASA 對前向運(yùn)動精子密度和活動特征的評估結(jié)果與體外受精率和受精時間有很好的相關(guān)性 (Liu et al.,1991a。 一些生產(chǎn)商生產(chǎn) CASA 系統(tǒng)，這些儀器能檢測精子的活動性和動力學(xué)，一些還可評價精子密度，少數(shù)設(shè)備還擁有半自動化的形態(tài)學(xué)模板。如果在樣品準(zhǔn)備和儀器使用中足夠細(xì)心，目前 CASA 仍可用于精子密度的常規(guī)診斷。然而隨著技術(shù)的進(jìn)步，特別是使用 DNA 熒光染色和尾部檢測計數(shù)法，已可進(jìn)行精子密度的測定 (Zinaman et al., 1996。l，在 120 分鐘里的產(chǎn)量，故修正因數(shù)為（ 1115/15） /120= 參考范圍 中性葡糖苷酶的參考值下限為每次射精≥ 20mU（來自于 Cooper 等， 1991；和 TG Cooper未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。mol）的產(chǎn)量。 （ ml），得到每次射出的精液中葡萄糖苷酶的總活性（ mU）。 10％以內(nèi)，即（估值 /估值的平均數(shù)間的差異） 100≤ 10％。 （ ，見注）以獲得未稀的精漿樣本中的中性葡萄糖苷酶的濃度（ IU/l）。mol/ L）。 ， 60 分鐘內(nèi)用 96 孔板測定儀在 405nm 波長下讀取結(jié)果。 250 181。 C 下震蕩混勻，孵化 2 個小時 (該反應(yīng)的關(guān)鍵是準(zhǔn)確的控制反應(yīng)的時間和溫度 )。l 的 PNPG 底物。l 的奧粟精胺以提供空白精漿值。 8181。包括雙份空白（ 15 181。 15181。 。 C 儲存待分析。 (參見 節(jié)，步驟 1)。mol/l標(biāo)準(zhǔn)液產(chǎn)生 160， 120， 80 和 40181。mol/l)定容至 10ml。 (在孵化后的 1 小時內(nèi)進(jìn)行 ) ：將 400 181。存放于加蓋的避光鋁箔瓶或棕色玻璃瓶中，在 4℃下保存。將樣品按照 1毫升分裝，凍存于 20℃下。每一次分析均應(yīng)使用新制備的試劑。仍可能會有少量晶體未溶解。 4．顯色試劑 2 ： 在 100 ml 顯色試劑 1 中溶解 g 的 SDS。 C 時會沉淀析出，但是稍經(jīng)加熱即會重新溶解。 2 ： 在 100 ml 緩沖液 1 中溶解 1 g 的 SDS。另外，尚需準(zhǔn)備以下試劑： 1 ( mol/l 的磷酸鹽，酸堿度 ) ： 在 100 ml 凈化水中溶解 g 的 K2HPO4?3H2O，之后在另一 100ml 凈化水中溶解 g 的 KH2PO4。 試劑 精液中附睪分泌的中性α 葡萄糖苷酶的測量試劑盒是可以通過商業(yè)途徑得到的。 原理 萄葡糖苷酶可將合成的吡喃葡萄糖苷底物轉(zhuǎn)化為在碳酸鈉條件下呈現(xiàn)黃色的 P硝基酚。下述方法需要靈敏度為 mU/ml 的96 孔測定儀（ Cooper 等， 1990b）。后者可以由鈉十二烷基的硫酸鹽 (SDS)選擇性地抑制 (Paquin 等， 1984)，從而保證對中性葡糖苷酶的測量，以反映附睪的功能。 von Eckardstein 等， 2020)，部分 逆行性射精以及雄激素不足的特征。 注釋：精液中果糖含量低是射精管梗阻，先天性雙側(cè)輸精管缺如 (de la Taille 等， 1998。 參考值下限 每次射精中的鋅的參考值下限為 13181。如果未達(dá)到該種結(jié)果，應(yīng)重新選取兩等份的精漿重新進(jìn)行檢測。 16（ 5微升精漿加入 75 微升的水和沉淀蛋白劑稀釋），以獲得稀釋后精漿的果糖濃度（ mmol / L）。 計算 ，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取樣本的果糖濃度 (mmol/l)。 ，以 96 孔透明膠薄膜板密封?；靹?，在冰水中冷卻 15 分鐘。 50 176。l 吲哚試劑到每支管中并混勻。l 的水）對照和雙份的標(biāo)準(zhǔn)品。 50 181。l 中加入加 l 濃度為 63 181。l精漿（使用正向置換型加樣器），充分混合。 ：向兩個 的試管中各加入 300181。 。 C 儲存待分析。 (見 節(jié)，步驟 1)。分為等份，于4℃或冷凍條件下保存。 C 下儲存。 C 的水浴中振蕩，將 25 毫克的吲哚溶解其中，并加凈化水至 100ml。 2. 脫蛋白質(zhì)試劑 2 (1 mol/l NaOH) ：在 100 ml 凈化水中溶解 NaOH g。 試劑 果糖測定的試劑盒可以通過商業(yè)途徑獲得，也可通過以下方式制備： 1 (63 181。 原理 在熱和酸性條件的影響下，果糖會形成一種有色的吲哚復(fù)合物。 Malm (1955)所述，使用的是靈敏度為 74μ mol/ L 的 96 孔板測定儀（ Cooper 等， 1990a）。 參考值下限 每次射精中的鋅的參考低值為 （來自于庫珀等， 1991；和 TG Cooper 未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。如果未達(dá)到該種結(jié)果，應(yīng)重新選取兩等份的精漿重新進(jìn)行檢測。 61（ 5 微升精漿以 300 微升水稀釋），以獲得未稀釋的精漿中的鋅濃度（ mmol / L）。 計算 ，自標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取鋅的濃度 (mmol/l)。l 顯色試劑，并在 96 孔板振 動器上震動混勻 5 分鐘。l）對照和雙份的標(biāo)準(zhǔn)品。 96 孔讀數(shù)板中加入步驟 3 中的雙份稀釋的精漿標(biāo)本各 40181。l 凈化水及 5181。含高中低鋅濃度的不同內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)本需同時檢測。無精子精漿可以合并以其它樣品為以后內(nèi)部質(zhì)量管理分析用試樣的提供標(biāo)準(zhǔn)。 操作 1000g 離心 10 分鐘， 收集無精子的精漿于 20176。 C 可保存 1 周。mol/l 另外五個的標(biāo)準(zhǔn)濃度。mol/l 的鋅標(biāo)準(zhǔn)液，將 100 181。 C。mol/l)：向 50 ml 的凈化水中溶解 g 的 ZnSO ，將 1 ml 上述溶液加入 99 ml 的水中稀釋 100 倍。只需使用染色 A試劑（規(guī)格為 2 60 ml ）和染色 B 試劑（規(guī)格為 1 30 ml）。 其原理為 5BrPAPS + Zn2+ → 5BrPAPSZn 復(fù)合物，可吸收波長為 560nm 的可見光。當(dāng)分光光度儀使用 3ml 或 1ml 的比色杯時，可以按比例調(diào)整精液和試劑的體積并在計算結(jié)果時做適當(dāng)校正。這種方法需要使用一個精確度為 4181。這種方法由Johnsen amp。 這可以通過所測量到該附屬性腺標(biāo)志物的濃度乘以所射精液的體積來得到。測定方法見 節(jié)所述。在精漿中存在兩種α 葡糖苷酶的