【正文】 )： SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 % 比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細(xì)胞生長的影響。 7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色23 min。 5. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。用已測試過之血清同時進(jìn)行對照組試驗。以不加血清之a(chǎn)MEM 稀釋細(xì)胞濃度為1102活細(xì)胞數(shù)/ ml。附血清之生長測試材料： MDCK cell (ATCC CCL34 或CCRC 60004) aMEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000022 ) 6well TC plate (or 35mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092013)步驟： 1. 以aMEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細(xì)胞于T75 flask 至80% confluency。有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。6. 血清之沈淀物. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份(plement) 去活化。4. heatinactivation 是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。5. 抗生素使用種類與濃度：抗生素工作濃度儲存溫度殺滅細(xì)菌penicillin(青霉素)100 units/ml20℃G(+) bacteriastreptomycin(鏈霉素)100 ug/ml20℃3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制mycoplasma 生長。 . 培養(yǎng)自其它實驗室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。 7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色23 min。 3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1)，室溫下靜置10 min。附配制培養(yǎng)基之生長測試材料： MDCK cell (ATCC CCL34 或CCRC 60004) 6well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092013)步驟： 1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 102 活細(xì)胞，同時作對照組實驗。 . mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。 . 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。電磁攪拌器 無菌血清瓶 ， mm無菌過濾膜 ，pH 計，真空泵，CO2 氣體. 步驟： . 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milliQ 水中，攪拌使其溶解。. 材料： 純水(milliQ 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要) ，粉末培養(yǎng)基 ，NaHCO3NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。 . 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 ℃, 15 lb, 20 分鐘處理。3. 滅菌︰ . 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。 . 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml2. 清洗︰ . ~ N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。 . plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml . 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyrene (PS) 為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管?；A(chǔ)篇實驗用品1. 種類︰ . 細(xì)胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。 . 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進(jìn)行實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45176。3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個細(xì)胞株之操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。細(xì)胞的交叉污染在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴(yán)重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細(xì)胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標(biāo)記為其他細(xì)胞株的細(xì)胞居然是 HeLa 細(xì)胞。90年代初美國的一個調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國的細(xì)胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對整個細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會使研究人員長期得到受病毒影響的細(xì)胞的實驗結(jié)果。由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在合適的環(huán)境中非常快速的生長。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原（即注射到動物體內(nèi)會導(dǎo)致動物發(fā)熱），所以通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等。細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。而我們研發(fā)的系統(tǒng)是確定的并且是廉價的。Kiessling表示，首個人類胚胎干細(xì)胞臨床試驗在進(jìn)行中，正在啟動人類患者更多試驗，相信在安全性問題上是至高至上的。根據(jù)新的報告，該系統(tǒng)也適用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，成人細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)重編類似于胚胎干細(xì)胞。新的培養(yǎng)系統(tǒng)利用一種人工合成的化學(xué)方法制成蛋白片段及多肽基質(zhì)，對干細(xì)胞有親和作用。目前，人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的大多是用于研究，然而，隨著時間推移培養(yǎng)系統(tǒng)會改進(jìn)，科學(xué)家們?nèi)杂檬笤醇?xì)胞及蛋白的支持干細(xì)胞生長的“表面”培養(yǎng)人類細(xì)胞，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞。然而，現(xiàn)在，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校（the University of WisconsinMadison）一研究小組報告，研制了一個完全確定的培養(yǎng)體系，為細(xì)胞治療提供更均一更安全產(chǎn)品The journal Nature Methods ，該小組由Laura Kiessling領(lǐng)導(dǎo)，一位威斯康星大學(xué)麥迪遜分校化學(xué)教授，介紹了一種廉價的、能（適應(yīng)）所有細(xì)胞的（培養(yǎng)）系統(tǒng)，從而免受培養(yǎng)（操作過程中）的不確定性工作（或因素的影響）。上述可進(jìn)行器官培養(yǎng)13周，每23天換液一次，并根據(jù)情況做進(jìn)一步實驗和檢測。將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO2 培養(yǎng)箱，并加注氧氣調(diào)整氧分壓，最好到90%。將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。s液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。加入3—5ml培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關(guān)酶抑制劑）。s液洗三次。s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。放置待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)。將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面。用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊，再用Hank39。 原代培養(yǎng)技術(shù)一、組織塊直接培養(yǎng)法取材，用Hank39。還有，動作要輕柔，盡量不要產(chǎn)生氣泡。我一般是等細(xì)胞完全變圓后才中止消化。在我看來，用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。在傳代的時候，初學(xué)者往往生怕細(xì)胞消化過度，早早地終止消化。老手細(xì)胞一扔好幾天不管，細(xì)胞瘋長。你跑去看細(xì)胞，培養(yǎng)瓶這么一晃，把因子都給晃散了。培養(yǎng)基中的生長因子是非常有限的。細(xì)胞越是養(yǎng)不好，就越是經(jīng)常去看。2. 不要頻繁看細(xì)胞。我在國內(nèi)從來就不燒瓶口。如果有細(xì)菌的話，這么晃兩下也燒不死多少。（當(dāng)然多多少少還是會有一點越用越堿，因為室溫還是比冰箱內(nèi)的溫度高）其實燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。培養(yǎng)基中的碳酸少了，當(dāng)然會變堿。瓶口在火焰上的時候，熾熱的空氣進(jìn)入瓶內(nèi)。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。有三個小經(jīng)驗和大家分享一下：1. 不要燒瓶口。我養(yǎng)過骨髓MSC、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、AD293腺病毒包裝細(xì)胞、PA317逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。，及時添加。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。注意事項：，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用?！姹?，約3060min。使用液：使用時，％即可。3. 滴入懸液時的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。：1. 計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。如果細(xì)胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：（長）（寬）（高）＝ 而 1ml＝1000mm3：，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；，否則影響計數(shù)準(zhǔn)確性。:按照下面公式計算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝ （ 四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) 2104說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細(xì)胞數(shù)。：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。：：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。具體操作：：取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間延長。將復(fù)合細(xì)胞計數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)24小時（或者2448小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細(xì)胞情況而定。，吹打制成細(xì)胞懸液。，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。，取出所需的細(xì)胞，同時核對管外的編號。、吸管、培養(yǎng)瓶等等。細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原則－快速融化：必須將凍存在196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。10磅20min高壓滅菌。傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項：：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上。最后要做好標(biāo)記。：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計數(shù)。，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。；：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。：注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。