【正文】 成本，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍. 綠原酸的研究進(jìn)展馬鈴薯是酚類(lèi)化合物（Phenolics）和一系列抗氧化劑（Antioxidants）的主要食物來(lái)源之一 [7].酚類(lèi)化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物，是多羥基酚類(lèi)化合物的總稱(chēng),它存在于包括馬（Phenolic Acids） 、類(lèi)黃酮類(lèi)（Flavonoids ） 、 二苯乙烯(Stilbenes)和木酚素類(lèi)（Lignans） [4].在馬鈴薯中，酚類(lèi)化合物主要分布在皮和皮層之間，約有 50%存在于皮及鄰近的組織中.酚類(lèi)化合物具備抗菌、抗誘變、氧化應(yīng)激會(huì)損害 DNA、蛋白質(zhì)和脂肪，導(dǎo)致慢性疾病例如癌癥，馬鈴薯中綠原酸的提取1質(zhì)之間的協(xié)同作用要比單一的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑提供更好的保護(hù)能力 [5].其中，酚類(lèi)化合物中約90%是綠原酸，所以，以綠原酸為主的酚酸類(lèi)物質(zhì)由于其潛在的健康效益在過(guò)去的幾年中逐漸被關(guān)注. 酚酸類(lèi)化合物酚酸類(lèi)化合物（Phenolic Acid）包括綠原酸(Chlorogenic Acid)、咖啡酸(Caffeic Acid) 、沒(méi)食子酸(Gallic Acid)、原兒茶酸(Protocatechic Acid)、芥子酸(Sinapic Acid)、香草酸 (Vanillic Acid)、丁香酸(Sringicy Acid)、阿魏酸(Ferulic Acid)、對(duì)香豆酸(Coumaric Acid)、水楊酸 (Salicylic Acid)等多種成分 [6].酚酸是馬鈴薯中含量較高的一類(lèi)生物活性物質(zhì)，研究表明酚酸與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性、醫(yī)療保健、人體健康和食品質(zhì)量等都有著密切的聯(lián)系 [8]. 綠原酸的分布、結(jié)構(gòu)及性質(zhì)綠原酸在可溶性酚酸類(lèi)化合物中是最為重要的物質(zhì)，綠原酸廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類(lèi)植物中，主要存在于忍冬科忍冬屬（Lonicera） 、菊科蒿屬（Artemisia）植物、金銀花、在蔬菜（如馬鈴薯、胡蘿卜、茄子 [9]）等日常食用品中都含有綠原酸類(lèi)物質(zhì).綠原酸（Chlorogenic Acid）是由咖啡酸（Caffeic Acid）與奎尼酸（Quinic Acid）組成的縮酚酸、異名咖啡鞣酸，化學(xué)名 3O 咖啡?？崴幔?Ocaffeoylquinic acid ） ，分子式：C 16H18O9，分子量：，是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)化合物 [10].綠原酸的半水合物為白色或微黃色針狀結(jié)晶，在 110℃時(shí)變成無(wú)水化合物， 25℃時(shí)水中溶解度約為 4%，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等極性溶劑，極微溶于乙酸乙酯，難溶于氯仿、乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑 [11].綠原酸的吸收波長(zhǎng)約為 330nm，對(duì)紫外光有較強(qiáng)的吸收性 .綠原酸的水溶液遇三氯化鐵呈綠色.綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成，為極性有機(jī)酸，性質(zhì)不太穩(wěn)定，這主要是由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)中有不飽和鍵、物的提取過(guò)程中，羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致綠原酸受熱、見(jiàn)光易氧化；熱敏感的化合物，在提取的過(guò)程中，應(yīng)注意溫度的控制，尤其是不能在高溫、強(qiáng)光及長(zhǎng)、冰箱（2℃）保存時(shí)最為穩(wěn)定[112] .圖 11 綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖江南大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文2 Chemical structure of chlorogenic acid 綠原酸的生物活性綠原酸具有廣泛的生物活性，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等： 降壓作用經(jīng)多年臨床試驗(yàn)證實(shí)的，綠原酸有明顯的降壓作用，而且療效平穩(wěn)，無(wú)毒、無(wú)副作 [13]研究發(fā)現(xiàn)杜仲綠降血壓的有效成分是松酯醇二葡萄糖苷，桃葉珊瑚甙，綠原酸，和杜仲綠原酸多糖類(lèi). 抑制突變和抗腫瘤現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明綠原酸有抗癌和抑癌之功效，日本學(xué)者研究了綠原酸的變異原性抑制作用(antimutagenicity) ，發(fā)現(xiàn)該作用與綠原酸等抗變異原性成分有關(guān)，揭示了綠原酸對(duì)腫瘤預(yù)防的重要意義 [].蔬菜、水果中的多酚類(lèi)如綠原酸、咖啡酸等可通過(guò)抑制活化酶來(lái)抑制致癌物黃曲霉毒素 B1 和苯并 [a]芘的變異原性；綠原酸還可通過(guò)降低致癌物的利用率及其在肝臟中的運(yùn)輸來(lái)達(dá)到防癌、肝癌和喉癌具有顯著的抑制作用，被認(rèn)為是癌癥的有效化學(xué)防護(hù)劑 [16]. 抗氧化作用綠原酸是一種有效的酚型抗氧化劑，其抗氧化能力要強(qiáng)于咖啡酸、對(duì)羥苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羥基茴香醚（BHA），是因?yàn)樗幸欢康?ROH 基，能形成具有抗氧化作用的氫自由基，以消除羥基自由基和超氧陰離子等自由基的活性，從而保護(hù)組織免受氧化作用的損害 [17]. 清除自由基、抗衰老、抗肌肉骨骼老化綠原酸及其衍生物具有比抗壞血酸、咖啡酸和生育酚 （維生素 E） 更強(qiáng)的自由基清除效果，可有效清除 DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基，還可抑制低密度、維持機(jī)體細(xì)胞正常的結(jié)構(gòu)和功能、防止和延緩腫瘤突變和衰老等現(xiàn)象的發(fā)生具有重要作用 [18].杜仲綠原酸含有一種可促進(jìn)人體的皮膚、骨骼、肌肉中膠蛋白的合成與分解的特殊成分，具有促進(jìn)代謝、防止衰退的功能，可用來(lái)預(yù)防宇航員因太空失重而引起的骨骼和肌肉衰退，同時(shí)發(fā)現(xiàn)杜仲綠原酸無(wú)論在體內(nèi)還是體外，均有明顯抗自由基作用. 抗菌、抗病毒作用綠原酸和異綠原酸對(duì)多種致病菌有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，對(duì)急性咽喉炎癥及皮膚病有明顯療效， Free 大學(xué) 教授在研究有些植物次生代謝物作為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑時(shí)，認(rèn)為綠原酸是有希望成為抗艾滋病病毒（HIV）的先導(dǎo)化合物 [19]. 這與英國(guó)專(zhuān)利報(bào)道的杜仲樹(shù)皮或葉的堿性提取物治療和預(yù)防艾滋病毒感染者很有效果的結(jié)論相一致 [20].馬鈴薯中綠原酸的提取3 對(duì)心血管保護(hù)作用綠原酸作為一種自由基清除劑及抗氧化劑已被大量的試驗(yàn)證明，綠原酸的這種生物活性， B 對(duì)大鼠具有較強(qiáng)促進(jìn)前異綠原酸 B 對(duì)大鼠具有較強(qiáng)促進(jìn)前列腺環(huán)素（PGI 2）的釋放和抗血小板凝集作用；對(duì)豚鼠肺碎片感應(yīng)的抗體誘導(dǎo) SRSA 釋放抑制率達(dá) %.異綠原酸 C 也有促進(jìn) PGI2 ，異綠原酸B 對(duì)血小板學(xué)栓素的生物合成和氫過(guò)氧化無(wú)誘發(fā)的內(nèi)皮素?fù)p傷有極強(qiáng)的抑制作用 [16]. 其它生物活性由于綠原酸對(duì)透明質(zhì)酸（HAase ）及葡萄糖6 磷酸酶（G l6Pase）有特殊的抑制作用，所以綠原酸對(duì)于創(chuàng)傷的治愈、皮膚健康濕潤(rùn)、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、防止炎癥以及體內(nèi)血糖的平衡調(diào)控等都有一定得療效 [21]；綠原酸具有預(yù)防糖尿病、顯著增加胃腸蠕動(dòng)和促進(jìn)胃液分泌等藥理作用；對(duì)月經(jīng)過(guò)多，子宮功能性出血有良好的止血效果；對(duì)急性咽喉炎癥有明顯，口服綠原酸能夠顯著的刺激膽汁的分泌，具有利膽保肝的功效；它還可有效抑制 H2O2 引起的大鼠紅細(xì)胞溶血作用 [12] . 綠原酸的制備 綠原酸的提取方法目前國(guó)內(nèi)外對(duì)綠原酸的提取方法研究上主要有石硫醇法、鉛鹽沉淀法、醇沉法、有機(jī)溶劑浸提法、回流提取法、索氏提取法、微波提取法、超聲輔助提取法以及超臨界流體萃取法等.靳學(xué)遠(yuǎn) [22]等研究了超高壓提取菊花中綠原酸的最佳工藝條件為：40%乙醇、超高壓壓力 300 MPa、超高壓力時(shí)間 min，粉碎度 60 目，綠原酸得率達(dá)到 %.張凌裳 [23]等利用酶解和超聲相結(jié)合的方法得到的最佳工藝條件為：溶劑 pH 為 ，酶解溫度為 40℃，料液比為 1：10，超聲時(shí)間為 30 達(dá) %.從與酶法和超聲波法的比較試驗(yàn)得出，綠原酸提取得率比酶解高出 %，比超聲波提取高出 %.王賢萍 [24]等研究了超聲波處理?xiàng)l件下超聲波的設(shè)備參數(shù)和提取操作參數(shù)對(duì)蘋(píng)果酚類(lèi)：功率 200 W，超聲頻率 40 KHz,提取溫度70℃，超聲提取時(shí)間 30 min，pH 為 3，料液比為 1: 10 的條件下，提取率達(dá) mg/kg.于基成 [25]等以綠茶為材料，采用超臨界 CO2 結(jié)果表明：提取時(shí)間為 1h，提取溫度為 60℃，壓力在 25 MPa 時(shí)，茶酚類(lèi)物質(zhì)的萃取率為 %.當(dāng)加入 65%的乙醇作為夾帶劑時(shí)，茶酚類(lèi)物質(zhì)萃取率可提高到 %. 綠原酸的合成，葡萄糖轉(zhuǎn)化成莽草酸（Shikimic Acid） ，莽草酸轉(zhuǎn)化成苯丙氨酸 PHE(phenylalanine)，后者經(jīng)合成酶作 []：江南大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文4圖 12 綠原酸可能的生物合成途徑 Possible biosynthetic pathway of chlorogenic acid 關(guān)于綠原酸化學(xué)合成的報(bào)道很少，已合成的綠原酸因未保護(hù)易水解基團(tuán)，產(chǎn)率不到 5%.近年 Michael[11]改進(jìn)了這種方法：通過(guò)以奎尼酸起始的四步化學(xué)反應(yīng)合成了綠原酸，總產(chǎn)率達(dá)到 65%.該方法的關(guān)鍵中間產(chǎn)物是選擇性修飾得到的雙縮醛化奎尼酸，在其 3 號(hào)位上與被保護(hù)的咖啡酰氯酯化，所得產(chǎn)物在酸性條件下水解去除保護(hù)性基團(tuán)就得到了綠原酸. 綠原酸的分析檢測(cè)方法酚酸的分析檢測(cè)方法有紫外分光光度法（UV） 、高效液相色譜法（HPLC） 、高效毛細(xì)管法（HPCE ），要應(yīng)用這兩種方法進(jìn)行馬鈴薯中綠原酸的分析檢測(cè).于華忠 [26]等在紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定茶葉中綠原酸的含量具有快速、簡(jiǎn)便、易于操作等特點(diǎn)，其線性方程為 C = A + ，相關(guān)系數(shù) r = ，回收率高達(dá)%.蘭小艷 [27]等在杜仲葉中綠原酸含量檢測(cè)的研究結(jié)果表明：紫外分光光度法測(cè)定的結(jié)果重復(fù)性好，精密度較高， 324 nm,標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為 ，加樣回收率達(dá)到 %，樣品中平均含量為 %.彭密軍 [28]等在制備型高效液相色譜法分離純化綠原酸中的最佳操作條件為：采用流速梯度進(jìn)行洗脫，流速先為 28 ml/min，然后為 45 ml/min；流動(dòng)相為 15%的有機(jī)酸 B 和%的有機(jī)酸 E（體積分?jǐn)?shù)） ；測(cè)定波長(zhǎng)為 254 nm；進(jìn)樣體積為 10 ml；進(jìn)樣量為 2500 ，制備回收率為 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 %，綠原酸純度達(dá)%.張建華 [29]等在高效液相色譜法測(cè)定馬鈴薯塊莖的綠原酸含量的實(shí)驗(yàn)中得到的最佳工藝是：C 18 色譜柱，250 nm* mm 5 um；流動(dòng)相：水甲醇冰醋酸（30:70:2） ；流速： ml/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：5 ：%.劉淼文 [30]等利用高效液相色譜法測(cè)定金銀花提取物中綠原酸的含量的實(shí)驗(yàn)中，方法是：國(guó)產(chǎn) C18 柱( mm*250 mm，7 um)；流動(dòng)相為乙腈： ％磷酸(12：88)；檢測(cè)波長(zhǎng)為 327 nm；流速 1 ml/min；進(jìn)樣量 10 ul；柱溫 25℃.結(jié)果：綠原酸在 ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0 .999 6；平均回收率 ％，RSD=％(n=6).糖酵解 磷酸烯丙醇式丙酮酸 奎尼酸D葡萄糖 5脫氫奎尼酸 磷酸戊糖支 4磷酸 赤蘚糖 5脫氫莽草酸 奎尼酸莽草酸 L苯丙氨酸 反肉桂酸 香豆酸 咖啡酸 綠原酸馬鈴薯中綠原酸的提取5 綠原酸的發(fā)展趨勢(shì)（美、日、德等）大多是從咖啡豆中提、皮膚防曬霜和防止紫外線和染發(fā)劑利用綠原酸的抗氧化特性研制出了抗衰老化妝品 [12].德國(guó)已有通過(guò)四步化學(xué)合成綠原酸的科學(xué)研究，使得綠原酸總產(chǎn)率達(dá)到 65%[11].我國(guó)一直是從金銀花、杜仲葉中提取綠原酸.對(duì)于綠原酸的純品我國(guó)主要依靠進(jìn)口，價(jià)格十分昂貴.目前，合理利用豐富的植物資源以及大力開(kāi)展綠原酸的提取純化和綠原酸產(chǎn)品的化學(xué)合成工藝是該領(lǐng)域的發(fā)展方向. 本課題研究的內(nèi)容、目的及意義近年來(lái)，隨著抗氧化、抗衰老研究的不斷深入以及消費(fèi)者對(duì)天然抗氧化劑需求的急劇增加，從植物中提取抗氧化、營(yíng)養(yǎng)成分全面，含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、無(wú)機(jī)鹽成分以及類(lèi)胡蘿卜素、酚酸等抗氧化物質(zhì)，酚酸具有抗氧化、 90%是綠原酸，綠原酸作為植物的一種次生代謝物，具有清除自由基、抗菌、抗病毒、增高白血球、降血脂、食品、日用化工等行業(yè).本課題擬從以下幾個(gè)方面進(jìn)行對(duì)馬鈴薯中綠原酸的研究:一、綠原酸的分析：用紫外吸收光譜法和高效液相色譜法進(jìn)行定性、定量分析.二、綠原酸的提?。豪贸暡ㄌ崛》?，得到最佳提取條件.三、綠原酸的純化：利用不同種類(lèi)的樹(shù)脂進(jìn)行吸附，選取最優(yōu)純化綠原酸用樹(shù)脂.四、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)：探討儲(chǔ)藏條件對(duì)馬鈴薯中綠原酸含量的影響.江南大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文6第 2 章 材料與方法 原料、藥品及儀器 原料及預(yù)處理 馬鈴薯將馬鈴薯清洗干凈并晾干，用不銹鋼刀具削皮，厚