【正文】 則所有的計(jì)算結(jié)果都是錯(cuò)誤的換算數(shù)據(jù)。這是因?yàn)椴还軋D象的實(shí)際大小，顯示的圖象幾乎都是那么大，如果是一張大圖片，因?yàn)轱@示時(shí)圖片被縮小了，所以標(biāo)尺也被縮小了，結(jié)果看上去文字與標(biāo)尺本身都顯得小而不清晰。IPP的標(biāo)尺功能好象有點(diǎn)BUG，有時(shí)候真的不靈。光看這些啰哩啰嗦的說(shuō)明肯定記不住。標(biāo)尺和文字都拖到位后再點(diǎn)continue，一旦點(diǎn)了continue就不能后悔了?，F(xiàn)在別著急點(diǎn)continue，在標(biāo)尺上用左鍵點(diǎn)一下，再用左鍵拖，把它移到位。點(diǎn)OK進(jìn)入下一步。當(dāng)Style樣式選用的是Nondestructive時(shí)，下面有三個(gè)不同的小尺形式。至此就永久地標(biāo)上了小標(biāo)尺了。繼續(xù)點(diǎn)continue回到標(biāo)尺選擇窗口（Active spatial calibration），現(xiàn)在就可以點(diǎn)OK關(guān)閉（可不能點(diǎn)marker按紐）標(biāo)尺選擇窗口了。它的位置就是上次選標(biāo)尺的位置。當(dāng)Style樣式選用的是ONimage時(shí)，下面有四個(gè)不同的小尺形式。，就消不掉了，所以標(biāo)記上標(biāo)尺的圖片最好另存一張。長(zhǎng)短要合適。具體方法下兩帖單獨(dú)講。再點(diǎn)擊marker按紐（不是點(diǎn)OK按紐）。，點(diǎn)適用的那個(gè)。 carlibration select spatial。誰(shuí)敢說(shuō)你用的顯微鏡或照相機(jī)有圖像變形，廠家會(huì)跟你急眼的。窗口下面的幾個(gè)選項(xiàng)都不要?jiǎng)铀?，保留默認(rèn)值。關(guān)閉窗口，再打開它，剛才那個(gè)標(biāo)尺就沒(méi)有了，可以重新新建標(biāo)尺。如果你覺得這個(gè)標(biāo)尺作得不對(duì)，得重作，可以重新打開窗口，在Name中選出這個(gè)標(biāo)尺，點(diǎn)image重新找端點(diǎn)。 大功告成了。，數(shù)一下兩個(gè)端點(diǎn)之間有多少間隔，這個(gè)微尺每格10um，兩端點(diǎn)間為二十小格，長(zhǎng)度為200um，所以要在scaling里填上200。而在刻線頭處，上下左右都有參照，可以準(zhǔn)確選中位置。另一個(gè)方法是把標(biāo)尺的兩端放在短刻線的線頭處，這樣選點(diǎn)更準(zhǔn)確。在這一步操作中，兩個(gè)端點(diǎn)位置必須準(zhǔn)確。 when change unit選項(xiàng)，給勾上。這是標(biāo)尺單位，顯微鏡圖片用微米來(lái)計(jì)量長(zhǎng)度單位最合適。別用中文字符。這是新建標(biāo)尺的名稱。1點(diǎn)擊菜單中的new按紐。圖中分別是100X、40X、10X物鏡下的微標(biāo)尺照片。我偷懶，只拍攝4種鏡頭下各自的標(biāo)尺照片，相機(jī)變焦與象素選擇都只用一種。4個(gè)鏡頭，五種變焦，三種象素。分別是低、中、高三個(gè)檔次。否則每個(gè)變焦都要拍攝標(biāo)尺照片。數(shù)字變焦不予考慮。我的相機(jī)有五級(jí)變焦，其中光學(xué)變焦三級(jí)，數(shù)字變焦兩級(jí)。如果你的像機(jī)是非變焦鏡頭，還不錯(cuò)。拍一張是不行的?？梢苑謩e用這些物鏡拍攝下不同的微標(biāo)尺圖象，在處理不同物鏡下拍攝的照片時(shí)使用各自對(duì)應(yīng)的標(biāo)尺。因此要特別注意，在拍攝微尺圖象與拍攝樣品圖象時(shí)，絕對(duì)不能調(diào)節(jié)相機(jī)的變焦（ZOOM）。在IPP中，程序先記住1MM相當(dāng)于多少象素，然后測(cè)量樣品圖象的幾何尺寸時(shí)只要先算出象素值，一換算就得了。在拍攝物體的同時(shí)也把米尺的圖象拍下來(lái)。上面說(shuō)的是使用顯微鏡照片時(shí)用的標(biāo)尺。它的尺寸就是1平方毫米，分了幾個(gè)大格和小格，線條精度雖然比不上微標(biāo)尺，但誤差也不會(huì)太大。照理說(shuō)如果有一個(gè)能放在載片上的尺寸已知的小東西也是可以的，這個(gè)東西首先得足夠小，其次得準(zhǔn)確知道它的尺寸。得在專業(yè)的顯微鏡生產(chǎn)商那才能買到，或者在買顯微鏡時(shí)把這個(gè)當(dāng)作附件給買下來(lái)。 標(biāo)定標(biāo)尺還需要有個(gè)物質(zhì)準(zhǔn)備，就是得有一個(gè)叫“微標(biāo)尺”的小玻璃片。所以關(guān)于光密度標(biāo)定的部分我也實(shí)在懶得費(fèi)力去寫了。 還有一個(gè)需要標(biāo)定的是光密度，這可就比幾何標(biāo)尺困難多了。 在前面的帖子中我一直沒(méi)提及標(biāo)尺，因此在提到測(cè)量面積直徑等幾何尺寸時(shí)都用象素作為單位。而且不會(huì)因?yàn)槟汴P(guān)閉程序或關(guān)閉電腦就能Reset了。校正標(biāo)尺在你打算學(xué)學(xué)標(biāo)尺的操作并自己動(dòng)手在自己電腦上玩玩標(biāo)尺之前，要確認(rèn)自己是要?jiǎng)诱娓竦貙W(xué)會(huì)怎樣設(shè)置這些東東。如果你想用IPP來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的話，一定要照下清晰干凈的照片再來(lái)處理。里面給出了兩類細(xì)胞的計(jì)數(shù)比例。具體作法大家當(dāng)作作業(yè)自己試試吧，我是用吸管工具來(lái)選色的，這張圖片大家很熟悉吧？里面有紅綠兩種顏色的細(xì)胞，可以用分類計(jì)數(shù)的方法同時(shí)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。這個(gè)麻煩事以后再談吧。class的意思就是分類。其實(shí)這里的問(wèn)題在于拍攝照片，如果能拍攝出清晰的細(xì)胞照片，沒(méi)有渣點(diǎn)，細(xì)胞分布也很均勻，用IPP來(lái)數(shù)密密麻麻的細(xì)胞還是能作到的。這跟split的操作類似，只是不劃線，而是畫一個(gè)圈，把幾個(gè)本應(yīng)在一起的Objects圍起來(lái)就行了。有挨在一起的細(xì)胞，就有一個(gè)細(xì)胞被識(shí)別成兩個(gè)以上object的。以便分割得更準(zhǔn)確。兩個(gè)挨著的山峰，在山腳處是相連的，如果山下漲了洪水，這兩座山峰就會(huì)徹底被水隔開了。這種分割方法是半自動(dòng)的。再回去count一遍，分割就生效了。split是手工分割，點(diǎn)此后出現(xiàn)一個(gè)小窗口，用鼠標(biāo)在相連的兩個(gè)object的連接處劃一條短線，將兩個(gè)分開，再點(diǎn)一下右鍵就行了。在count/size窗口的edit菜單下，上面的幾個(gè)split命令就是用來(lái)分割連在一起的object的。而另外還有細(xì)胞因?yàn)樘?，被識(shí)別成兩個(gè)甚至更多的object了。還有問(wèn)題。圖中可以看到，如果把面積下限定到100象素，就只剩下16個(gè)細(xì)胞了。再下面是統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，可以動(dòng)態(tài)地看到過(guò)濾后的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。此表的橫坐標(biāo)數(shù)是面積的象素值，縱坐標(biāo)是對(duì)應(yīng)像素值面積有多少個(gè)object。調(diào)出count/size中的select measurement窗口，點(diǎn)一下中間filt range窗口中的area，再點(diǎn)一下下面的edit range按紐，調(diào)出來(lái)edit range窗口。圖片中的細(xì)胞都有一定大小，那些只有幾個(gè)像素的小綠點(diǎn)顯然不是一個(gè)細(xì)胞。調(diào)出statistics窗口就可以看到自動(dòng)計(jì)數(shù)結(jié)果了。所以選擇計(jì)數(shù)測(cè)量時(shí)可以讓電腦自動(dòng)選取亮物體作為識(shí)別標(biāo)志。那還是用count/size工具吧。當(dāng)圖片中的細(xì)胞數(shù)目多得一眼看不出有多少個(gè)，但同時(shí)也不是多得密密麻麻的時(shí)候，比如幾十個(gè)吧，用這招最簡(jiǎn)單。最簡(jiǎn)單的數(shù)細(xì)胞的工具是measuremeasurement窗口，下圖中左邊紅線框住的工具就是計(jì)數(shù)的工具。因?yàn)闆](méi)作過(guò)具體的計(jì)數(shù)分析，因此這一主題寫起來(lái)就有點(diǎn)尷尬了。我在實(shí)際工作中很少用這個(gè)程序來(lái)計(jì)數(shù)，原因是不實(shí)用。計(jì)數(shù)其實(shí)在前面的操作中，我們經(jīng)常是在計(jì)數(shù)。關(guān)于宏的討論到此結(jié)束。還有個(gè)招就是把一組照片全部同時(shí)打開，測(cè)量一個(gè)圖關(guān)閉一個(gè)圖，直到最后一張。（這個(gè)動(dòng)作也可以作一個(gè)宏嘛，用快捷鍵ctrl S就很方便）就可以操作下一張圖了。一個(gè)細(xì)胞一秒鐘就搞定。得花幾秒鐘吧？如果用宏操作。數(shù)數(shù)你得點(diǎn)多少下鼠標(biāo)。有意義嗎？算算帳就知道了。調(diào)出record macro窗口，起個(gè)名字叫test1，定義其快捷鍵為ctrl D，用ctrl B可以嗎？當(dāng)然可以，但B在鍵盤中間，同時(shí)按ctrl 與B鍵是不是挺累手的？點(diǎn)OK后記錄的操作動(dòng)作很簡(jiǎn)單： AOI to object AOI點(diǎn)stop recording macro結(jié)束。再處理下一張圖片。我們就把這個(gè)重復(fù)動(dòng)作編成一個(gè)宏，把這步操作簡(jiǎn)化到兩步：用鼠標(biāo)移園圈到下一個(gè)細(xì)胞，按一下宏快捷鍵。同時(shí)它的測(cè)量數(shù)據(jù)會(huì)直接顯示在數(shù)據(jù)窗口中。調(diào)出測(cè)量數(shù)據(jù)顯示窗口和測(cè)量值統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)窗口，現(xiàn)在可以看到第一個(gè)細(xì)胞的測(cè)量數(shù)據(jù)已經(jīng)顯示出來(lái)了。注意：不能點(diǎn)count/size菜單中的count按紐。，把這個(gè)圓轉(zhuǎn)換成一個(gè)object。，再?gòu)闹姓{(diào)出select measurement窗口，選擇area、density（mean）、以及IOD項(xiàng)。就是那個(gè)正圓的AOI選擇按紐。對(duì)這張圖片中的所有細(xì)胞都這么測(cè)一遍，求其平均值。分析目標(biāo)是每張片子中各個(gè)細(xì)胞的蛋白表達(dá)強(qiáng)度，也就是其“黃色”的深與淺。 上面作的示例稍微有點(diǎn)復(fù)雜，接下來(lái)咱們?cè)僮饕粋€(gè)簡(jiǎn)單一點(diǎn)的。宏錄制錯(cuò)了想修改能作到嗎？當(dāng)然能，但你得會(huì)編程語(yǔ)言。二百五十張圖片一會(huì)就處理完了。幾秒鐘宏運(yùn)行結(jié)束后再處理下一張。如果是數(shù)據(jù)順序排列的話，不用管Excel。每次處理圖片時(shí)任何窗口都不必打開，只要打開圖片，按一下宏運(yùn)行的快捷鍵ctrl A。有兩個(gè)delete動(dòng)作是不是有點(diǎn)多余？不，它可以節(jié)省宏運(yùn)行時(shí)間的。 to Excel。 背景選色數(shù)值文件。，計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)會(huì)馬上顯示在statistics窗口中。 color 調(diào)出segmentation窗口。別忘了在錄制宏之前打開一個(gè)Excel空工作簿。，一步也不能操作錯(cuò)喲，否則你的錯(cuò)誤操作會(huì)被記錄在案，并且在每次運(yùn)行宏操作時(shí)都重復(fù)這些錯(cuò)誤。用與ctrl或shift位置較近的字母如ASZXWQ或OPLKM之類。名字得是八個(gè)字母的英文名。要填上Macro Name和Shortcut key。，打開count/size窗口，還有空著的statistics窗口。這樣DDE的設(shè)定就不會(huì)悄悄地變化了。設(shè)定了DDE option后，不要關(guān)閉statistics窗口。如果行列值都填為0，那么每次都會(huì)存在同一個(gè)地方。append next date set to the right 下一組數(shù)據(jù)放在前一級(jí)數(shù)據(jù)的右邊。如果想讓數(shù)據(jù)重新從左上角開始填，那就必須把這個(gè)行列值給改回1。position data set row 1 col 1 這是指定數(shù)據(jù)從Excel表單的具體哪個(gè)位置開始放，現(xiàn)在的行列值都是一，就是左上角。 這是說(shuō)數(shù)據(jù)將存到Excel中活動(dòng)表單中了，還有一個(gè)選擇是填sheet 1 。里面是Excel程序的文件位置，好長(zhǎng)呢，別動(dòng)它。在DDEoption窗口中從上到下需要填的選擇是：target program：Excel 這是廢話，不必改，就這樣了。設(shè)置一下測(cè)量數(shù)據(jù)傳往Excel的規(guī)則，這很重要。，如果打不開的話可先點(diǎn)一下count隨便測(cè)量個(gè)數(shù)值。，選好陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域的分色后，點(diǎn)擊下面file中的save file，把這個(gè)分色設(shè)定也保存成一個(gè)文件，也起一個(gè)有意義的英文文件名。宏操作前的準(zhǔn)備：，（包括select measurement、class option設(shè)置）點(diǎn)擊file菜單的 save settings 將這些設(shè)置保存成一個(gè)文件，保存位置最好放在與待處理圖片一起的文件夾中。在編制宏操作時(shí)，因?yàn)槭亲詣?dòng)操作，所以不能有人工選擇干預(yù)的操作動(dòng)作。，再次count，把統(tǒng)計(jì)數(shù)值傳入Excel。蛋白表達(dá)區(qū)的HSI分色數(shù)值為H：028，S與I都是0255。class object 標(biāo)記為標(biāo)記class顏色，組織空白區(qū)域較亮的地方為背景區(qū)域。得到滿意的結(jié)果后，就可以按照這個(gè)既定的操作程式進(jìn)行宏的編制了。對(duì)于分析免疫組化圖片這樣的復(fù)雜操作，制作一個(gè)宏來(lái)進(jìn)行分析，節(jié)省下來(lái)的時(shí)間就更可觀了。例如：一大批圖片，需要把它們的象素調(diào)整到一個(gè)較小的值以便上傳到網(wǎng)上。這還不包括你因?yàn)椴僮麇e(cuò)誤所耽誤的時(shí)間。但是當(dāng)你作了兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每組5只，每只動(dòng)物切出來(lái)五張組織切片，每張切片選取了5個(gè)視野拍下了照片，這就一共有2*5*5*5=250張照片。實(shí)際上宏不過(guò)是把一連串的操作集合到一個(gè)操作的有效工具。請(qǐng)繼續(xù)閱讀下一主題。這個(gè)操作在使用宏操作時(shí)是必須的。在處理一組多個(gè)圖片的時(shí)候，不能每個(gè)圖片都選擇一次顏色，這樣各個(gè)圖片的選擇標(biāo)準(zhǔn)不一致，而且費(fèi)時(shí)間。窗口最下方的file按紐是用來(lái)保存顏色選取參數(shù)的。如果把一部分選成black，其效果就等于把這一部分從圖象中摳去，這個(gè)處理也是很有用的。下面一個(gè)選項(xiàng)則是對(duì)選中區(qū)域與非選中區(qū)域分別標(biāo)上不同顏色的選擇，我一般選擇class color on transparent。在segmentation窗口的下方還有一些有用的功能。另一種是在Histogram Based 模式中利用HSI范圍來(lái)選取目標(biāo)顏色。盡管幫助文件是英文的，看起來(lái)有點(diǎn)困難，但中文的幫助文件翻譯得不準(zhǔn)確，有時(shí)比英文的還難懂呢。在前面的圖象里，選好顏色后，點(diǎn)一下用紅圈標(biāo)注的那個(gè)按紐，就實(shí)現(xiàn)了反向選擇。在選文件夾與word的edit菜單里都有這項(xiàng)功能。選AOI也是這樣，如果選得不合心意，想全部重新來(lái)的話，按count/size窗口中的delete鍵，就可以把剛才作的一切都給全部推倒重來(lái)了。 凡是玩電腦都必會(huì)有一個(gè)reset鍵。顯微鏡圖象千差萬(wàn)別，每一次進(jìn)行分析都需根據(jù)具體的圖像情況來(lái)選擇AOI方法。把那些通過(guò)顏色選擇不能排除的object給進(jìn)一步排除掉。改完后點(diǎn)一下旁邊的Filter按紐，再點(diǎn)measure按紐，或者回到count/size窗口內(nèi)把Apply Filter Ranges in Range前面的選項(xiàng)給勾上，再點(diǎn)count按紐，這回就把小雜質(zhì)點(diǎn)全給過(guò)濾掉了。對(duì)area來(lái)說(shuō)，默認(rèn)值一般是0，意思是不管區(qū)域有多小，都被計(jì)入測(cè)量范圍內(nèi)。打開select measurement窗口，點(diǎn)一下中間被選中測(cè)量項(xiàng)目中的area項(xiàng)，使其加亮。圖片中被選中的區(qū)域有許多很小的選點(diǎn)，顯然這是各種雜質(zhì)，并不是成片的蛋白表達(dá)區(qū)域。這樣操作結(jié)束后仔細(xì)觀察一下計(jì)算的區(qū)域，正是剛才正確選取的區(qū)域了。回到count/size窗口，按count紐，也一樣不好用！?。』蛘唿c(diǎn)count后計(jì)算的區(qū)域根本就不是剛才選取的正確區(qū)域。選好了顏色范圍，點(diǎn)close關(guān)閉segmentation窗口，回到count/size窗口，點(diǎn)measure的select measurement ，選中area, density（mean），IOD。色飽和度S與強(qiáng)度I都直接設(shè)為0255。點(diǎn)一下H，直方圖顯示就是圖片各象素H值的分布，在直方圖的兩邊各有一根線，這就是選擇線，先將右邊的線用鼠標(biāo)左鍵向里面拉，拉一點(diǎn)停一下看看效果，可以看到最開始時(shí)是選中了全部畫面，然后是藍(lán)色的區(qū)域慢慢顯露出來(lái)，并且越顯越多，選擇線的位置也在下面的窗口中有顯示，是0255之間的數(shù)，共有兩個(gè)窗口，左邊是取值下限，右邊是取值上限，先不斷減小上限值使得非黃色區(qū)域不斷地顯露出來(lái)，再不斷增加下限值讓另一部分非黃色的區(qū)域也顯露出來(lái)。S為色飽和度，I為強(qiáng)度。這時(shí)的顏色選擇全部重置為0255。我們要選取后者，并且使用HSI顏色格式來(lái)進(jìn)行分色選擇。選manual，并點(diǎn)select color調(diào)出segmentation