【正文】 。分析樣品與基礎(chǔ)樣品兩值之差為干擾值?！　∷懈鳂悠肪麟p份葡萄糖測定取平均值?！　?)分析樣品：＋ 442μmol/L肌酐溶液。⒈方法基本與回收試驗一樣，但是加入的是疑有干擾或非特異性反應(yīng)的物質(zhì)而不是標準液。在加入一定濃度的干擾物的條件下， 形成的是恒定系統(tǒng)誤差。理想的結(jié)果期望回收率達到100％，％，％的比例誤差，若用該方法測定，(％)，(％)。平均―②⒈　方法將被分析的純品標準液加入病人樣品中，成為分析樣品，原病人樣品加入相同量的無分析物的溶液作基礎(chǔ)樣品，然后用實驗方法分析，兩者測定結(jié)果的差值為回收量。（二）回收試驗所謂回收即分析方法正確測定加入常規(guī)分析樣品中的純分析物的能力。 表201　評價實驗與分析誤差類型的關(guān)系分析誤差的類型評價實驗　初步試驗最后試驗偶然誤差批內(nèi)(或天內(nèi))重復(fù)性天間重復(fù)性恒定誤差干擾與比較方法對比比例誤差回收評價實驗與分析誤差類型的關(guān)系方法學(xué)評價(evalution of methodology)的基本內(nèi)容是通過實驗途徑，測定并評價方法的精密度與準確度，在實驗中測定的是不精密度與不準確度，不倫精密度還是準確度，強調(diào) 的都是誤差，評價實驗的過程就是對誤差的測定。這類標準品可由實驗室自己配制或為商品，其中有關(guān)物質(zhì)的量由參考方法定值或用一級標準品比較而確定，主要用于常規(guī)方法的標化或為控制物定值。一級標準品都有證書，在美國由國家標準局（NBS）發(fā)給合格證書，并指明它的性質(zhì)和有關(guān)數(shù)據(jù)。⒈一級標準品一級標準品（原級參考物）是已經(jīng)確定的穩(wěn)定而均一的物質(zhì)，它的數(shù)值已由決定性方法確定，或由高度準確的若干方法確定，所含雜質(zhì)也已經(jīng)定量。臨床化學(xué)方法之間關(guān)系可見圖202。所謂偏差已知的方法是指準確度已經(jīng)確定的方法，其準確度不明者稱為偏差未知的方法。它也用于鑒定二級標準品，為質(zhì)控血清定值，也可用于評價商品試劑盒等。這類方法應(yīng)在條件優(yōu)越的實驗室中應(yīng)經(jīng)常使用。由于技術(shù)要求太高，費用昂貴，不直接用于鑒定常規(guī)方法的準確性，只用于發(fā)展及評價參考方法和標準品。方法和標準品的分級（一）方法的分級臨床生化成分的測定方法很多，根據(jù)其準確度與精密度的不同可以分為三級。它是金屬螯合劑，能除去重金屬離子，從而解除重金屬對酶的抑制作用。這是由于這些酶需要其分子中的巰基處于還原狀態(tài)才具有催化作用。① 如Mg2+是多種激酶和合成酶的激活劑；② Cl是唾液淀粉酶最強的激活劑。激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響（1）激活劑(activator) 凡能使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚蕴岣叩奈镔|(zhì)，通稱為激活劑。② 非競爭性抑制作用 有些抑制劑可與酶活性中心以外的必需基團結(jié)合，但不影響酶與底物的結(jié)合, 酶與底物的結(jié)合也不影響酶與抑制劑的結(jié)合，但形成的酶底物抑制劑復(fù)合物(ESI)不能進一步釋放出產(chǎn)物，致使酶活性喪失?；前奉愃幬锸堑湫偷睦印＠纾罕?、蘋果酸有與琥珀酸相似的結(jié)構(gòu)，它們是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。① 競爭性抑制作用：此類抑制劑一般與酶的天然底物結(jié)構(gòu)相似，可與底物競爭酶的活性中心，從而降低酶與底物的結(jié)合效率，抑制酶的活性。即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。圖35所示為巰基酶的失活與恢復(fù)。例如：烷化巰基的碘代乙酸、某些重金屬(Pb2+、Cu2+、Hg2+)及對氯汞苯甲酸等，能與酶分子的巰基進行不可逆結(jié)合。圖 34 羥基酶的失活與恢復(fù)②非專一性不可逆抑制此類抑制劑可與酶分子結(jié)構(gòu)中一類或幾類基團共價結(jié)合而導(dǎo)致酶失活。酶的活性恢復(fù)：有機磷殺蟲劑可用含有CH=NOH基的肟化物，或羥肟酸RCHNOH衍生物將其從酶分子上取代下來，使酶的活性恢復(fù)。例如：有機磷殺蟲劑能專一地作用于膽堿酯酶活性中心的絲氨酸殘基，使其磷?；茐拿傅幕钚灾行? 導(dǎo)致酶的活性喪失。按其作用特點，不可逆抑制又有專一性及非專一性之分。其實際效應(yīng)是降低反應(yīng)體系中有效酶濃度。2. 根據(jù)抑制劑與酶分子之間作用特點的不同，通常將抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。也就是說，酶并未變性，去除抑制劑后，酶活性又可恢復(fù)。一種抑制劑只能引起某一類或某幾類酶的抑制。圖 33 pH對酶活性的影響抑制劑對反應(yīng)速度的影響(inhibitor) 凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 （2）影響底物和輔酶的解離程度 從而影響酶與底物的結(jié)合。酶濃度對反應(yīng)速度的影響在一定的溫度和pH條件下，當?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度時，酶的濃度與反應(yīng)速度呈正比關(guān)系，見圖32。⑤ 測定不同抑制劑對某一酶Km及Vmax的影響，可以用于判定該抑制劑是競爭性抑制劑還是非競爭性抑制劑。在各底物濃度相當時，Km值大的酶則為限速酶。② 催化可逆反應(yīng)的酶，當正反應(yīng)和逆反應(yīng)Km值不同時，可以大致推測該酶正逆兩向反應(yīng)的效率，Km值小的底物所示的反應(yīng)方向應(yīng)是該酶催化的優(yōu)勢方向。① Km值的大小，可以近似地表示酶和底物的親和力,Km值大,意味著酶和底物的親和力小，反之則大。當pH、溫度和離子強度等因素不變時，Km是恒定的。由此可見，Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度。當?shù)孜餄舛群芨撸╗S]Km）時，ν≈Vmax，反應(yīng)速度達到最大速度，再增加底物濃度也不再影響反應(yīng)速度。（二）米氏方程 式中Vmax為最大反應(yīng)速度（maximum velocity），[S]為底物濃度，Km為米氏常數(shù)（Michaelis constant），ν是在不同[S]時的反應(yīng)速度。這說明酶已被底物所飽和。 圖 31底物濃度對反應(yīng)初速度的影響從圖中可以看出：1．在底物濃度很低時，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟上升，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)；2．隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度變緩，表現(xiàn)為混合級反應(yīng)；3．如果繼續(xù)增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級反應(yīng)。因此對酶促反應(yīng)動力學(xué)的研究，具有重要的理論和實際價值。這些因素主要包括酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑和激活劑等。蘋果酸脫氫，為草酰乙酸。琥珀酸脫氫（FAD），為延胡索酸。步驟概括為：草酰乙酸和乙酰輔酶A合成檸檬酸檸檬酸異構(gòu)為異檸檬酸異檸檬酸脫氫脫羧，為a酮戊二酸。三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)是糖，脂肪和蛋白質(zhì)三種主要有機物在體內(nèi)徹底氧化的共同代謝途徑，三羧酸循環(huán)的起始物乙酰CoA，不但是糖氧化分解產(chǎn)物，它也可來自脂肪的甘油、脂肪酸和來自蛋白質(zhì)的某些氨基酸代謝，因此三羧酸循環(huán)實際上是三種主要有機物在體內(nèi)氧化供能的共同通路，估計人體內(nèi)2/3的有機物是通過三羧酸循環(huán)而被分解的。1個分子葡萄糖經(jīng)無氧酵解僅凈生成2個分子ATP，而有氧氧化可凈生成38個ATP，其中三羧酸循環(huán)生成24個ATP，在一般生理條件下，許多組織細胞皆從糖的有氧氧化獲得能量。厭氧型生物則首先遵循同樣的途徑分解高能有機化合物，例如糖酵解，但之后并不進行三羧酸循環(huán)，而是進行不需要氧氣參與的發(fā)酵過程。 四：三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)基本介紹 三羧酸循環(huán)真核生物的線粒體和原核生物的細胞質(zhì)是三羧酸循環(huán)的場所。 　　7．腎性糖尿：由于腎小管重吸收機能減低，腎糖閾下降，以致腎小球濾液中正常濃度的葡萄糖也不能完全重吸收，此時出現(xiàn)的糖尿，稱為腎性糖尿。 　　6．肥胖癥可出現(xiàn)糖耐量曲線異常，由于醫(yī)學(xué)教 育網(wǎng) 原創(chuàng)脂肪細胞對胰島素不敏感，糖耐量常可降低。 　　4．肝臟疾病，慢性肝炎患者可出現(xiàn)糖耐量降低。 　　2．內(nèi)分泌疾病，如腎上腺皮質(zhì)機能亢進疾病(如柯興綜合征)，有70%~80%病人有糖耐量降低；反之腎上腺皮質(zhì)功能減退，垂體前葉功能不全等，都可呈現(xiàn)低平糖耐量曲線。各時限血糖均在正常上限內(nèi)，屬正常。 　　不同年齡段糖耐量結(jié)果的血糖值上限（mmol/L） 時限（分）年齡40歲以下40～49歲50～59歲60～69歲70歲以上空腹3060120180　　結(jié)果判斷 　　服葡萄糖后各時限血糖或空腹血糖、高峰值與2小時血糖值大于相應(yīng)年齡的正常上限者可診斷為糖尿病。 　　4．測定血糖濃度，并繪制耐糖曲線：將各次所測得的血糖濃度與對應(yīng)的時間作圖，繪制糖耐量曲線。 　　3．在5分鐘之內(nèi)飲入300毫升含7 5克葡萄糖的糖水（，計算口服葡萄糖用量，直至達到75克葡萄糖時止），喝糖水后30分鐘、1小時、2小時分別靜脈取血一次，并留取尿液做尿糖定性試驗。Ⅰ型特點：常見于青少年；起病較急；血漿胰島素及C肽含量低，糖耐量曲線呈低平狀態(tài) ；β細胞的自身免疫性損傷是重要的發(fā)病機制，多可檢出自身抗體；治療依賴胰島素為主；易發(fā)生酮癥酸中毒；遺傳因素在發(fā)病中起重要作用，與HLA相關(guān) Ⅱ型特點：典型病例常見于肥胖的中老年成人；起病較慢；血漿中胰島素含量絕對值并不降低，但在糖刺激后呈延遲釋放；ICA等自身抗體呈陰性；單用口服降糖藥一般可以控制血糖；發(fā)生酮癥酸中毒的比例不如Ⅰ型；有遺傳傾向，但與HLA基因型無關(guān)　3：OGTT試驗葡萄糖耐量試驗的方法 　　1．做OGTT試驗前3天，停止胰島素治療，可正常飲食，每天飲食中碳水化合物含量不應(yīng)低于150克（但要控制在250～300克范圍），并且維持正?；顒?。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例約為95％。 （5）血糖濃度高于腎閾（～／L，160～180mg／dl）時可隨尿排出一部分。 　?。?）轉(zhuǎn)化成非糖物質(zhì)：轉(zhuǎn)化為甘油、脂肪酸以合成脂肪；轉(zhuǎn)化為氨基酸以合成蛋白質(zhì)。 　　 　?。?）氧化分解：葡萄糖在組織細胞中通過有氧氧化和無氧酵解產(chǎn)生ATP，為細胞代謝供給能量，此為血糖的主要去路。 　?。?）肝糖原分解：短期饑餓后，肝中儲存的糖原分解成葡萄糖進入血液， 　?。?）糖異生作用：在較長時間饑餓后，氨基酸、甘油等非糖物質(zhì)在肝內(nèi)合成葡萄糖。 　　血糖濃度之所以能維持相對恒定，是由于其來源與去路能保持動態(tài)平衡的結(jié)果。 　　血糖恒定的主要意義是保證中樞神經(jīng)的供能。　　血液中的葡萄糖稱為血糖。此外，依據(jù)待檢反應(yīng)體系中所用的是生物素化第一抗體或生物素化第二抗體，又分為醫(yī)|學(xué)教育網(wǎng)搜集整理直接法BAS和間接法BAS。多余的金標記抗HCG移行至C區(qū)時被抗小鼠IgG抗體捕獲，而顯示出紅色對照線條十：生物素親和素系統(tǒng)基本類型及原理：　　基本類型有兩種，一類以游離親和素為中間物，分別連接包含生物素大分子的待檢反應(yīng)體系和標記生物素，稱為BAB法；后來又在此基礎(chǔ)上發(fā)展了親和素生物素化酶復(fù)合物技術(shù)（ABC）。兩個抗人βhCG單克隆抗體，一個抗體吸附于硝酸纖維素薄膜（NC）上，另一個抗體結(jié)合于金溶膠顆粒表面。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大大提高檢測的靈敏度。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。生物素（biotin）又稱維生素H，存在于蛋黃中。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4 個生物素分子親密結(jié)合。　?。?）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性lgM抗體存在，為陽性反應(yīng)?！　。?）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性lgM 結(jié)合?！　。?）加入稀釋的血清標本：保溫反應(yīng)后血清中的lgM 抗體被固相抗體捕獲。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上，在除去lgG后再測定特異性lgM?！　。ㄎ澹┎东@法測lgM抗體　　血清中針對某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時存在，后者會干擾lgM抗體的測定?！　。?）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標抗原最多，故顏色最深，參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與同相抗體的結(jié)合可達最充分的量。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。操作步驟如下：　　（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌。　?。ㄋ模└偁幏ǎ骸　?競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體?！　。?）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去?！　。?）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。操作步驟如下：　?。?）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原?！　。ㄈ╅g接法測抗體 ：　　間接法是檢測抗體時最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平?！　。ǘ╇p位點一步法：　　在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。　?。?）加酶標抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合?！　。?）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標記的抗原或抗體，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。這種被稱為EL1SA 的檢測技術(shù)成為目前臨床檢驗中應(yīng)用較廣的免疫測定方法。但常用的酶免疫測定法為固相酶免疫測定。　　在異相法中，抗原和抗體如在液體中反應(yīng)，分離游離和結(jié)合的標記物的方法有許多種。如在抗原反應(yīng)后，先把Ab*Ag與Ab* 分離；然后測定Ab*Ag或Ab*中的標記物的量，從而推算出標本中的抗原量，這種方法稱為異相法。八：酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)的分類