【正文】 年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞取自白內(nèi)障患者手術(shù)中取出的前囊膜（晶狀體上皮細(xì)胞緊貼于前囊膜），直徑約 5mm。 撰寫(xiě)方法： — 以時(shí)間順序?yàn)橹骶€設(shè)計(jì)技術(shù)路線 — 以研究?jī)?nèi)容為主線設(shè)計(jì)技術(shù)路線 — 分大小標(biāo)題，突出邏輯關(guān)系。 技術(shù)路線 存在問(wèn)題： 不清楚，不詳細(xì)，不可行。 過(guò)于繁雜：大量羅列一些常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法。②采用直徑 12μm玻璃微管在顯微鏡下將病毒載體注入晶狀體的前囊膜下，既不破壞晶狀體的完整性，又可使病毒接觸到囊膜下的上皮細(xì)胞。 在體晶狀體的基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵是如何使大量分裂后細(xì)胞轉(zhuǎn)染，如何使病毒穿過(guò)晶狀體的囊膜，針對(duì)以上問(wèn)題我們擬采取下列方法解決：①選用反轉(zhuǎn)錄病毒的慢病毒載體（ lentiviral vector ），它克服了一般反轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染有分裂能力細(xì)胞的局限性，對(duì)分裂后細(xì)胞也能有效的轉(zhuǎn)染。 （ 3）在體基因轉(zhuǎn)染： 在體基因轉(zhuǎn)染是進(jìn)行白內(nèi)障相關(guān)基因功能研究的關(guān)鍵。在制作基因芯片時(shí)做到：①嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行；②在標(biāo)本的處理及 RNA提取時(shí)避免污染，否則即會(huì)造成嚴(yán)重的損失。 （ 2）制備基因芯片： 制備用于本研究的芯片是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 ②利用改良的消減雜交技術(shù)可快速、有效地獲得差異表達(dá)的完整 cDNA片段。 舉例 ： （ 1）建立差異表達(dá)的 cDNA文庫(kù) ： 建立差異 cDNA文庫(kù)是篩選老年性白內(nèi)障相關(guān)基因的前提。 為達(dá)預(yù)期目標(biāo)所必須掌握的關(guān)鍵技術(shù)或研究手段。 （ 2）研究白內(nèi)障相關(guān)基因的結(jié)構(gòu) ： …… （ 3）研究白內(nèi)障相關(guān)基因在晶狀體上皮細(xì)胞變化中的作用 ： …… 觀察指標(biāo)如下： ①存活細(xì)胞數(shù) ； ②光鏡、透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化 ；③細(xì)胞凋亡檢測(cè) ：用原位末端標(biāo)記和連接酶介導(dǎo) PCR方法，從形態(tài)和 DNA水平分析細(xì)胞凋亡； ④細(xì)胞增殖的檢測(cè) ： …… ； ⑤細(xì)胞骨架蛋白的檢測(cè) ： …… ； ⑥晶狀體蛋白的檢測(cè) ： 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題： 存在問(wèn)題： 抓不住關(guān)鍵問(wèn)題或抓得不準(zhǔn)。 研究?jī)?nèi)容： 存在問(wèn)題： 內(nèi)容過(guò)多，一個(gè)研究周期難以完成 內(nèi)容分散，不能集中闡明研究目標(biāo) 撰寫(xiě)要求： 內(nèi)容要適當(dāng) — 確保研究周期內(nèi)完成 為目標(biāo)服務(wù) — 與目標(biāo)相輔相成 要重點(diǎn)闡述 — 注意與技術(shù)路線區(qū)別 舉例 ： （ 1）篩選白內(nèi)障相關(guān)基因： 采用改良的消減雜交技術(shù)，獲得人老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞和正常晶狀體上皮細(xì)胞差異表達(dá)的基因片段，建立 cDNA文庫(kù)。 C、文獻(xiàn)年代要新 ：主要是近五年的文獻(xiàn)，最好能有 07年的最新文獻(xiàn)。 參考文獻(xiàn) A、文獻(xiàn)類別要全 ：以英文文獻(xiàn)為主，同時(shí)也要引用 中文文獻(xiàn) 國(guó)內(nèi)同行中知名專家的文獻(xiàn)。 綜上所述，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究白內(nèi)障發(fā)生過(guò)程中的功能基因及特異調(diào)控基因提供了有利武器。 由于目前尚沒(méi)有針對(duì)白內(nèi)障研究的現(xiàn)成基因芯片，根據(jù)本研究的需要，我們將篩選到的差異表達(dá)的所有基因建立 cDNA文庫(kù)，再利用基因芯片技術(shù) 制備成基因芯片 ，以此 檢測(cè)多個(gè)樣本中白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間差異表達(dá)的基因， 從中 進(jìn)一步篩選出白內(nèi)障特異的基因 ，它們中可能有已知基因，也可能有未知基因。 基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使檢測(cè)差異表達(dá)基因和未知DNA分子變得更快捷、準(zhǔn)確、高效。 該方法的建立者已利用這一技術(shù)從脂多糖刺激前后的人牙髓細(xì)胞的差異表達(dá)的基因中克隆到脂多糖刺激后特異表達(dá)的基因，其中 5個(gè)為新基因。 經(jīng)過(guò)改進(jìn)后的抑制性消減雜交 （ suppression subtractive hybridization ,SSH是 Diatchenko等 1996年建立的方法） …… 簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，但仍然問(wèn)題很多。 尋找白內(nèi)障時(shí)晶狀體上皮細(xì)胞與正常晶狀體上皮細(xì)胞間 差異表達(dá)的基因 有可能揭示白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理。 但就 DDPCR技術(shù)來(lái)講，在實(shí)驗(yàn)中難以解決假陰性、假陽(yáng)性以及克隆全長(zhǎng) cDNA的問(wèn)題。 Lee[17]利用 RTPCR技術(shù)研究顯示前極性白內(nèi)障與核性白內(nèi)障上皮細(xì)胞中纖維連接蛋白、 I型膠原纖維、 α平滑肌蛋白、TGFβ TGFβ TGFβⅡ 型受體、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)有差異。 雖然體外實(shí)驗(yàn)和白內(nèi)障轉(zhuǎn)基因小鼠都提示我們一些基因的變化與白內(nèi)障有關(guān)，但是，這些變化的基因是否與老年性白內(nèi)障形成有關(guān)，目前尚缺乏進(jìn)一步的報(bào)告。晶狀體改變的共同特點(diǎn)是晶狀體纖維細(xì)胞分化受抑制 [14,15]。 二是利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究。 UVB輻射作用誘導(dǎo)的白內(nèi)障中晶狀體上皮細(xì)胞是主要的靶細(xì)胞，其 NaKATP酶的活性增加，蛋白質(zhì)的合成和分泌增加；上皮細(xì)胞的凋亡增加，其中有 cfos基因的表達(dá)增加；還有組蛋白 H H3 的低表達(dá) `和蛋白酶 C、β肌動(dòng)蛋白、 γ肌動(dòng)蛋白基因的高表達(dá) [912]。晶狀體的老化是多種因素相互作用的結(jié)果， 包括基因的和非基因的隨機(jī)變化的不斷積累，也有程序性的、非隨機(jī)性的組織特異性 多種基因表達(dá)的改變。而 晶狀體上皮細(xì)胞變化的基因調(diào)控機(jī)制 是問(wèn)題的關(guān)鍵所在，也是有待我們深入研究的問(wèn)題。 體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí) 多種因素 (H2O UVB、晶狀體蛋白的自身抗體 )誘發(fā)的白內(nèi)障模型中 晶狀體上皮的損傷是晶狀體混濁的主要環(huán)節(jié) [68]。 因?yàn)?晶狀體上皮細(xì)胞 是晶狀體中唯一有分裂活性、數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞，它們分裂、分化出晶狀體纖維細(xì)胞、產(chǎn)生晶體蛋白，終生不停息，形成了晶狀體均一、對(duì)稱的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持晶狀體的透明起重要作用。 就致病的環(huán)境因素講， 氧化因子、紫外線輻射、晶狀體周圍環(huán)境中離子濃度改變及一些生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的改變均與老年性白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。 防治白內(nèi)障必須針對(duì)其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)。 例如：抗體 + 功能基團(tuán)，理論上可以實(shí)現(xiàn)融合，但存在“活性、表達(dá)載體選擇、純化等問(wèn)題。 新方法在詳細(xì)介紹其原理的基礎(chǔ)上