【正文】 成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麥芽糖等糖，溴甲酚紫(B．C．P)、溴麝香草酚蘭(B．T．B)或酚紅(P．R)等指示劑。（一）細(xì)菌生化反應(yīng)常用培養(yǎng)基的制備 1．蛋白胨水 成分：、蒸餾水100ml ，分裝試管，15磅15min高壓滅菌備用。然而，這些不同種型的細(xì)菌，其物質(zhì)代謝能力和產(chǎn)物常有所不同，借此可以鑒別細(xì)菌，即為細(xì)菌的生化反應(yīng)檢查，生化反應(yīng)檢查必須使用純種細(xì)菌。高層培養(yǎng)應(yīng)采用穿刺接種法，用接種針取菌落或斜面培養(yǎng)基上的純種細(xì)菌，穿刺于培養(yǎng)基的中心，但不可直刺至試管底，一般刺入高層培養(yǎng)基三分之二高度即可(圖2—4)。接種后放37℃溫箱培養(yǎng)18~24h，肉眼觀察，如培養(yǎng)基出現(xiàn)混濁或形成菌膜、沉淀等，則表示有細(xì)菌增殖，觀察其增殖狀態(tài)，有助于鑒別細(xì)菌。此培養(yǎng)物來自孤立菌落，為純種，可用于該菌的各種生物學(xué)性狀檢查。劃線完畢，再將試管口通過一下火焰，棉塞滅菌后，塞好棉塞，最后將接種環(huán)上的殘留細(xì)菌用火焰滅菌。接種時(shí)，右手持接種環(huán)，先將接種環(huán)滅菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的細(xì)菌。2．斜面培養(yǎng)基接種的純培養(yǎng)法 斜面培養(yǎng)基不易污染，常用于培養(yǎng)純種細(xì)菌。以上所學(xué)習(xí)的是最經(jīng)典的培養(yǎng)方法，目前臨床檢驗(yàn)常使用全自動(dòng)培養(yǎng)儀，大大提高了培養(yǎng)的效率和質(zhì)量。挑菌時(shí)不要取菌太多，不要觸碰其它菌落，涂膜切勿太厚，否則影響鏡檢效果。用接種環(huán)按無菌操作取材法沾取生理鹽水，于每一圓圈內(nèi)各放一滴。 ②細(xì)菌形態(tài)：選擇經(jīng)肉眼詳細(xì)觀察過的不同種類的孤立菌落各一個(gè)，用特殊鉛筆在平皿底部作圈記并編號(hào)，然后再涂膜，做革蘭氏染色。雜菌一般生長于劃線痕跡外，或?yàn)閭€(gè)別的形狀異常的孤立菌落。 透明度：透明、半透明、不透明等。 結(jié)構(gòu)：均質(zhì)性、顆粒狀等。 表面：光滑、皺紋、濕潤、干燥等。 大菌落(直徑在5mm以上) 中等大菌落(直徑在3mm左右) 小菌落(直徑在1mm左右) 形狀：點(diǎn)狀、圓形、卵圓形、葉狀等。 【結(jié)果觀察】 ①菌落形態(tài)：首先一般先觀察整個(gè)平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及種類，然后再選有代表性的各種孤立菌落做如下的詳細(xì)觀察。在平皿底面，用特殊鉛筆寫上班級(jí)、學(xué)號(hào)和材料號(hào)，然后使平皿底面向上放于鐵絲筐中，送37℃溫箱培養(yǎng)，經(jīng)18～24h，可觀察有無孤立菌落生長，每一孤立菌落即為一純種細(xì)菌?？筛鶕?jù)菌量的不同，決定分段的數(shù)目。再將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后再劃線于“2”區(qū)。 ②分段劃線法：檢查材料中含菌量較多時(shí)，可用此法以求獲得孤立菌落。劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面所成的角度要小，以免劃破瓊脂。先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取檢查材料，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線至平板的中部，然后將平板旋轉(zhuǎn)180176。 【方法】1．平板培養(yǎng)基接種的分離培養(yǎng)法 平板培養(yǎng)基具有較大的表面積，用于從混雜的檢查材料中分離出純種細(xì)菌，其要點(diǎn)是如何獲得較多的孤立菌落。本次實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)法，掌握幾種常用的細(xì)菌接種技術(shù)。實(shí)驗(yàn)2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)細(xì)菌分離培養(yǎng)法是指將臨床材料接種于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(Media)上進(jìn)行孵育，分離獲得純種細(xì)菌的方法。 2．待冷至50℃左右時(shí)，加入無菌的脫纖維血液，混勻(注意勿使產(chǎn)生泡沫)。(三)血液瓊脂培養(yǎng)基 有些細(xì)菌其營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)菌不能分解瓊脂，故無營養(yǎng)作用，僅是固體培養(yǎng)基的賦形劑。 4．趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。 2．趁熱用pH試紙測酸堿度，用10％。 【材料】 ① 肉水 200ml ② 蛋白胨 2g ③ 氯化鈉 1g ④ 瓊脂 5g ⑤ 無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。 如用市售的牛肉膏代替新鮮肉水時(shí)，～％的水溶液，再如上法制成培養(yǎng)基。過堿時(shí)，可用10％醋酸校正之。 2．1000ml肉水中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g，加熱溶解，放涼。 【方法】 1．將新鮮牛肉500g切碎或攪碎，加水1000ml，放4℃冰箱或冷處浸泡過夜，然后煮沸30min，放涼，使殘余的脂肪凝固，再用絨布或?yàn)V紙過濾，將濾液補(bǔ)足為原量。(一)肉湯培養(yǎng)基 肉湯培養(yǎng)基是常用的液體培養(yǎng)基，也是制備常用的細(xì)菌分離培養(yǎng)基及其他某些培養(yǎng)基的基礎(chǔ)?；A(chǔ)培養(yǎng)基中所含的營養(yǎng)物質(zhì)能滿足一般病原菌生長繁殖所需的氮源、碳源和無機(jī)鹽等。要求同學(xué)們了解培養(yǎng)基的制作原則和方法，掌握細(xì)菌的分離培養(yǎng)技術(shù)。 (劉 兵)第二章 細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)感染性疾病的診斷關(guān)鍵在于病原菌的分離與鑒定，人工培養(yǎng)法為細(xì)菌提供必要的生長條件，使其在體外生長繁殖。再用美藍(lán)染液染色半分鐘，水洗，吸干，鏡檢。用石碳酸復(fù)紅染液加熱染色1min，水洗。同時(shí)可能看到?jīng)]有芽胞的繁殖體和失掉菌體的芽胞。 【結(jié)果觀察】 芽胞染成綠色，菌體染成紅色。 2．滴加3％孔雀綠水溶液加熱染色3～6min，水洗。本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生了解兩種特殊染色法并認(rèn)識(shí)這種細(xì)菌特殊構(gòu)造。 乙液 堿性復(fù)紅酒精飽和液 1份實(shí)驗(yàn)5 芽胞染色法 芽胞(Spore)是細(xì)菌的休眠狀態(tài)，對(duì)各種理化因素有強(qiáng)大的抵抗力，能耐受惡劣環(huán)境的影響。鞭毛很細(xì)，經(jīng)染色處理后，鞭毛和菌體都比實(shí)際粗大。B．typhi是周身帶有鞭毛的桿菌。 2．染色 滴加戶田氏染色液，～5min，水洗，吸干，鏡檢。 【材料】 ① 傷寒桿菌(Bacillus typhi)斜面純培養(yǎng)物(注：系首先將細(xì)菌在肉湯中多次傳代，然后移種于加少量蒸餾水的瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)7~16h)。細(xì)菌的鞭毛很纖細(xì)，直徑僅20nm，不能用普通顯微鏡觀察，不易被普通染色法染色，只有經(jīng)特殊染色處理，增加鞭毛直徑，才能在光學(xué)顯微鏡下觀察。在小白鼠組織細(xì)胞周圍，有散在成對(duì)的小尖矛形的紫色細(xì)菌，細(xì)菌周圍有一淡紫色的亮圈，即為莢膜。用濾紙吸干后鏡檢。 2．染色 ① 取一濾紙片覆蓋于涂膜上，滴加結(jié)晶紫溶液，并在火焰上略加熱至出現(xiàn)蒸氣為止(約1min)。本實(shí)驗(yàn)要求學(xué)生了解特殊染色法并認(rèn)識(shí)這種細(xì)菌特殊構(gòu)造。2．常見的與醫(yī)學(xué)有關(guān)細(xì)菌的革蘭氏染色性 葡萄球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、 球菌 八疊球菌、肺炎鏈球菌等 枯草桿菌 需氧芽胞桿菌 革蘭氏陽性菌 炭疽桿菌 有芽胞菌 破傷風(fēng)桿菌 厭氧芽胞桿菌 產(chǎn)氣莢膜桿菌 桿菌 肉毒桿菌 白喉?xiàng)U菌 無芽胞菌 結(jié)核桿菌 腦膜炎球菌 球菌 淋球菌 大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌 革蘭氏陰性菌 腸道桿菌 沙門氏菌屬：食物中毒沙門氏菌、 桿菌 傷寒桿菌、副傷寒桿菌 非腸道桿菌：百日咳桿菌、鼠疫桿菌 霍亂及副霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)3 莢膜染色法 細(xì)菌的莢膜(Capsule)具有保護(hù)細(xì)菌抵抗吞噬和消化的作用，可增加細(xì)菌的侵襲力。取復(fù)紅飽和液10ml，與5％石碳酸水溶液90ml混合，用濾紙過濾，再用蒸餾水稀釋10倍。供革蘭氏染色媒染用。供革蘭氏染色初染用。加入酒精全量為100m1，制成酒精飽和液 (原液)。②被檢菌的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分、菌齡的不同等原因會(huì)影響染色結(jié)果，如革蘭氏陽性菌的陳舊培養(yǎng)物也有出現(xiàn)革蘭氏陰性的幾率，所以被檢菌的菌齡一般最好在18~24h之內(nèi)。 注意事項(xiàng)：①酒精脫色是革蘭氏染色中的重要環(huán)節(jié)，如脫色過度，則革蘭氏陽性菌可能被誤染為革蘭氏陰性菌，如脫色不夠，則革蘭氏陰性菌可能被誤染為革蘭氏陽性菌，所以脫色時(shí)間要很好掌握。 【結(jié)果觀察】 使用油鏡觀察，注意標(biāo)本中兩種細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪種細(xì)菌是革蘭氏陽性菌(染成紫色)，哪種細(xì)菌是革蘭氏陰性菌(染成紅色)。 ⑤水洗，用濾紙輕輕吸干，待標(biāo)本充分干燥后進(jìn)行鏡檢。 ③水洗后用95％酒精脫色，脫色時(shí)頻頻搖動(dòng)玻片，直至流下的液體無色為止()。 4．染色： ①將結(jié)晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。 3．固定：用染色夾子夾住涂片，在火焰的最熱部分連續(xù)通過三次，以固定之。 2．干燥：放空氣中自然干燥。 用斜面培養(yǎng)物涂片： 用細(xì)菌斜面培養(yǎng)物涂片，需預(yù)先取一接種環(huán)生理鹽水放在載物片上，然后再按無菌操作取材法從斜面培養(yǎng)物上取少量菌苔，在水滴內(nèi)輕輕研磨將細(xì)菌制成菌懸液，再涂成一薄膜。 ⑥ 將接種環(huán)上之材料涂于載物片上，隨后立即將接種環(huán)用火焰燒灼滅菌。 ④ 用滅菌后已冷卻的接種環(huán)伸入試管中取出材料(圖1—3)，此時(shí)注意勿使沾有材料的接種環(huán)觸碰試管壁及試管口。角放在煤氣燈的外焰中燒灼滅菌，直到把金屬絲燒紅(圖1—2)，然后將鋁制的銀色柄部也通過火焰略加燒灼。 1．涂片：按無菌操作取材法進(jìn)行，具體步驟如下： 用肉湯培養(yǎng)物涂片： ① 右手拿接種環(huán)的黑色塑料柄部分，左手托持試管。準(zhǔn)備載物玻片：用鑷子從載物片缸中取出經(jīng)3％鹽酸酒精脫脂的載物玻片，用擦片布擦凈，~，做為涂膜的標(biāo)記范圍。而革蘭氏染色陰性菌（G—）細(xì)胞壁脂類含量多，肽聚糖層數(shù)少，且肽聚糖為平面片層結(jié)構(gòu)，易被乙醇溶解，使細(xì)胞壁通透性增高，結(jié)合的染料復(fù)合物容易泄漏，細(xì)菌被脫色為無色，再經(jīng)石炭酸復(fù)紅稀釋液復(fù)染成紅色?！驹怼考?xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫初染染成藍(lán)色。前端通常用細(xì)電爐絲制成，損壞時(shí)可自行更換；也可用白金絲制作，但價(jià)格昂貴。本法較懸滴法簡單，但標(biāo)本容易干涸，不能長時(shí)間觀察(注意：勿將菌液壓溢到玻片邊緣之外)。小心地把蓋玻片放于液滴之上，勿使中間產(chǎn)生氣泡，中間液層越薄越好。按細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性的不同，可以推知細(xì)菌有無鞭毛，這是鑒別菌種的要點(diǎn)之一。它們可向不同方向運(yùn)動(dòng)，速度較快，相互間的位移很大。用低倍鏡找出懸滴的邊緣，然后換用高倍鏡或油鏡觀察滴內(nèi)細(xì)菌的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。同法再以葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物做一懸滴片。 【材料】 ① 枯草桿菌6~12h肉湯培養(yǎng)物 ② 葡萄球菌6~12h肉湯培養(yǎng)物 ③ 凡士林 ④ 載玻片、凹玻片、蓋玻片、接種環(huán)、煤氣燈 【方法】(一)懸滴法取清潔的凹玻片和蓋玻片各一張，涂少許凡士林于凹玻片窩的周圍；取一接種環(huán)枯草桿菌肉湯培養(yǎng)物滴于蓋玻片之中央，將蓋玻片迅速翻轉(zhuǎn)，復(fù)蓋于凹玻片窩上(圖1—1)。，注字準(zhǔn)確清楚，并應(yīng)向右側(cè)指線。 繪 圖 法。先用低倍鏡，再用高倍鏡或用油浸鏡。主要用肉眼觀察，必要時(shí)結(jié)合放大鏡。最后將物鏡頭轉(zhuǎn)成“人”字形，降落鏡筒或上抬載物臺(tái)，稍微下降集光器，對(duì)號(hào)送入鏡盒內(nèi)。觀察血涂片標(biāo)本時(shí)，必須按一定順序，逐個(gè)視野檢查，以免遺漏。觀察滴片標(biāo)本時(shí)，載物臺(tái)應(yīng)放平，注意勿將物鏡鏡頭接觸糞液。 ※用油浸鏡觀察微生物標(biāo)本時(shí)，應(yīng)將顯微鏡亮度開關(guān)調(diào)至最亮，集光器升至最高，光柵打至最大。觀察完畢，應(yīng)先提高鏡筒，并將高倍鏡（或油浸鏡）頭扭向一側(cè)，再取下玻片。眼從側(cè)方看，調(diào)節(jié)粗螺旋，使鏡頭浸入鏡油中至接近玻片時(shí)為止（注意勿壓碎玻片）。有時(shí)顯微鏡本身存在偏心現(xiàn)象，此時(shí)要記住其偏心的方向和距離。用粗螺旋調(diào)至看出物象后，再調(diào)節(jié)微螺旋，使物像更加清晰。2．調(diào)光：檢查未染色標(biāo)本時(shí)，以弱光線為宜，此時(shí)可將集光器下降或縮小光柵，檢查染色標(biāo)本時(shí)，以光線強(qiáng)為宜，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)升高集光器或?qū)⒐鈻糯蜷_。顯微鏡的使用方法 【目的】要求熟練掌握顯微鏡的使用方法，尤其是油浸鏡的使用方法。8．實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)整理好，值日同學(xué)打掃室內(nèi)衛(wèi)生，并檢查水、電、煤氣等開關(guān)是否關(guān)好，防止發(fā)生安全事故。7．易燃物品（酒精、二甲苯等）不準(zhǔn)接近火源。6．注意節(jié)約實(shí)驗(yàn)試劑，愛護(hù)實(shí)驗(yàn)器材。4．如遇有盛檢驗(yàn)材料的器皿破損或污染其它物品時(shí)，應(yīng)即用3%的來蘇兒消毒；皮膚破傷須向指導(dǎo)教師報(bào)告，采取適當(dāng)?shù)南炯胺乐垢腥敬胧?．實(shí)驗(yàn)室要保持肅靜和秩序，不得高聲談笑和隨處走動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1．上實(shí)驗(yàn)課時(shí)，先到更衣室把個(gè)人的