【正文】 用手握持雙耳提起兔子 家兔的固定： 盒式固定：常用于經口給藥，兔耳血管注射、采血或觀察兔耳血管變化等。 另一種方法：張開左手虎口，迅速將拇指，食指插入大鼠腋下，虎口向前，其余三指及掌心握住大鼠身體中端，并使其保持仰臥位，之后調整左手拇指位置，緊抵在下頜骨上。判斷 結果的可信性 （結果應為陰性） ② 交叉實驗 ③ 替代實驗 ④ 置換實驗 ⑤ 陽性對照 動物實驗技術 實驗動物的抓取 一 小鼠 用左手拇指和食指抓住兩耳和頸部皮膚，其余三指和手掌心夾住背部皮膚和尾部 小鼠的灌胃針長 45cm,直徑 34cm,常用灌胃量 皮內注射量：最多不得超過 . 皮下注射部位：背部 肌內注射：股部 腹腔注射： 靜脈注射：多用尾靜脈，用溫水浸泡尾部或乙醇擦拭，使血管擴張， 4號細針 一次注射量為 ，盡可能從尾端開始向尾根部移動注射， 腦內注射： 注射針垂直刺入 23mm, 二 大鼠 大鼠 捉持方法與小鼠相似。 切片邊緣，刀痕或皺褶區(qū)域，壞死或擠壓的細胞區(qū)，膠原結締組織等表現為相同的染色強度，不能判斷為陽性 免疫熒光細胞化學染色方法 熒光抗體法： 用熒光抗體示蹤 或檢查相應抗原的方法 熒光抗原法： 用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法 對照：抗原對照，抗血清對照，滅活補體對照。 SP 法與 ABC 法比較，特異性更高 2 酶標親和素 — 生物素技術（ BA LAB） 制備生物素化抗體和酶標親和素，利用生物素 — 親和素的親和作用，將酶標親和素連接到抗原抗體復合物上，以顯示被檢測的抗原。 ② 第 2 抗體（橋抗體）必須過量 （四）親和素 — 生物素方法 1 親和素 — 生物素 — 過氧化物酶復合物技術（ ABC） 通過 ABC 復合物中親和素橋梁的作用，將 ABC 復合物與生物素化的抗體結合在一起 ，達到檢測抗原的目的。 2 PAP 法 將游離酶和抗酶抗體在使用前先制成穩(wěn)定的酶 — 抗 酶抗體復合物，在稀釋后使用。 特點：將熒光素或酶標記在第二抗體上 優(yōu)點： ① 不用標記第一抗體 ② 第一抗體的工作稀釋度高 ③ 敏感性增強 ④ 應用范圍更廣 ⑤ 特異性低于直接法 （三）未標記抗體法 1 酶橋法 酶橋法使用的三種抗體中的 第 1，第 3 兩種抗體為同種動物所產生。 理想的標記酶： ① 酶的活性高并且穩(wěn)定 ② 終產物穩(wěn)定，不擴散，有良好的定位 ③ 酶與抗體和結合不影響 Ag— Ab 的特異性反應 ④ 在組織與體液 中不存在內源性的酶 底物 效果好又應用最多的是辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶 異硫氰酸熒光素： 為明亮的黃綠色熒光 四甲基異硫氰酸羅丹明： 為橙紅色熒光 免疫組織化學主要染色方法的原理 （一）直接法 （又稱一步法） 特異性高，敏感性低 原理：用已知的特異性抗體與熒光素或酶結合，直接與待測組織中的抗原反應。染色 液置 4℃冰箱 內 保存，可反復使用，用前回溫。 ② 二甲苯苯胺油分化后，必須用二甲苯洗除 ③ 結晶紫溶于乙醇，草酸銨溶于蒸餾水 二 Ziehl— Neelsen 抗酸桿菌染色法 結果： 抗酸桿菌 紅色 背景 灰藍色 注意事項： ① 苯酚復紅液，必須加溫 37℃ 40℃ ,時，秩序染色 1520 分鐘 ② 亞甲藍復染后用 95%乙醇快速分化，防止過度脫色 三 Warthin— starry 胃幽門螺桿菌 染色法 結果：胃幽門螺桿菌呈棕黑色或黑色，背景淡 黃色 注意事項： 1%硝酸銀液內 1h 左右（溫箱 56℃） 四 螺旋體染色 Giemsa 染色法 結果 螺旋體及細菌呈藍到淡紫色 ，細胞質呈藍色，紅細胞呈橘黃色 注意事項：放入 Giemsa 染色工作液中需要 818h 或更長 五 HBsAg 染色 （一） Shikata 地衣紅染色法 結果： HBsAg 陽性呈棕色 注意事項 ① 高錳酸鉀須新配制 ② 地衣紅染色液 PH 應為 （二）醛復紅改良染色法 結果： HBsAg 陽性呈紫色 ， 結締組織呈紅色， 紅細胞及基質呈黃色 （三）維多利亞藍染色法 結果： HBsAg 陽性呈藍綠色 ， 細胞核紅色 注意事項：① 維多利亞藍染液中需放置 1224h. 神經組織染色 神經細胞尼氏小體染色法 （一）焦油紫染色法 結果： 尼氏小體 紫色 膠質細胞 淡紫色 背景 無色 (二 ) Einarson 棓酸青藍染色法 結果： 尼氏小體 黑藍，紫色 核 藍色 背景 淺灰色 （三）甲苯胺藍染色法： 結果： 尼氏小體 深藍色 核 淡藍色 背景 無色 神經纖維染色方法 （一） Hol,mes 神經纖維染色方法 結果： 神經纖維 黑色 背景 灰紫色 （二） Bielschowsky 神經纖維染色 結果： 神經纖維 黑色 背景 紫色 （三） Von Braunmubl 神經纖維，扣結，老年斑染色方法 結果： 神經纖維 和扣結 黑色 老年斑 黑色 背景 淺灰色 （四） Eager退變神經纖維的染色方法 結果：退變神經纖維 黑色 背景 淺棕色 神經髓鞘染色方法 （一） Weigert 髓鞘染色方法 結果：髓鞘 黑紫色， 背景：淡灰色 （二） Weil 髓鞘染色方法 結果：髓鞘 藍黑色， 背景：淡灰色 （三） Kultshitzky 髓鞘染色方法 結果： 結果：髓鞘 藍黑 色， 背景：淡黃 色 （四） Luol fast blue 髓鞘染色方法 結果： 髓鞘 藍色 核仁 紫色 尼氏小體 紫色 （ 五 ） 變色酸 2R亮 綠髓鞘染色方法 結果：神經髓鞘呈深紅色；軸索和間質呈 綠 色，脫髓鞘纖維不著色。 （二） Gram甲紫染色法 結果： 纖維蛋白 藍黑色 ， 背景 紅色 淀粉樣物質染色 （一）剛果紅染色法 結果： 淀粉樣物質： 紅色 細胞核 藍色 注意事項： 蘇木精染色的細胞核不能深 淀粉樣物質可以結合偏光的方法得到良好的效果 ，其色彩呈綠色雙折光性。 ③ 組織固定不能使用酸性固定液。 阿爾辛藍染色 30 分鐘，或更長 （二） Schiff 阿爾辛藍地衣紅染色法 1 結果： 胃粘膜腸化生上皮和胃腸腫瘤的酸性粘多糖： 藍色 中性粘多糖： 棕色 ： ① 高錳酸鉀氧化液必須新配制使用 ② 地衣紅染色液冰箱保 存，可反復使用 ③ 地衣紅染色時間 4h,阿爾辛藍染色 5 分鐘，時間不能長。 早期心肌病變組織染色 （一） Nagar— Olsen 結果： 缺氧心肌 ，紅細胞 紅色 正常心肌 黃色或黃棕色 細胞核 藍色 （二） Poley 顯示缺氧心肌染色法 結果： 缺氧心肌 紅色 胞核 紫色 其他： 綠色 七：糖類染色 糖原染色：過碘酸 Schiff(PAS)染色法 1 結果： 糖原及其他 PAS 反應陽性物質 紅色 細胞核 藍色 ： 過碘酸是一種 氧化劑 染色前將 Schiff試劑取出后，適應室溫后再進行染色 八．粘液物質（粘多糖）染色 中性粘多糖多見于：胃粘膜的表面上皮，十二指腸腺，頜下腺，前列腺上皮，結腸的杯狀細胞。 六 肌肉組織染色 （一） 橫紋肌組織 染色 Mallory 磷鎢酸蘇木精染色法 （ PTAH） 1. 結果： 橫紋肌 藍色 膠原纖維，網狀纖維： 黃色或玫瑰紅色 心?。ㄈ毖毖酰? 紫藍色或 棕黃色 2． 注意事項 ： ① ．此液經陽光處理數周后至數月才成熟，置冰箱內保存可使用多年時間。 3 固定液：以 甲醛生理鹽水 固定的染色效果最佳。 橘黃 G 染液： 2：對特殊的蛋白質及含硫酸 根的粘多糖有很強的親和力，和彈力纖維結合很緊。不能與水接觸，直接用無水乙醇沖洗脫水 ②：膠原纖維切片的厚度需 6um, ③ : Victoria blue 染色液應盛染色缸內，進行染色。 樹脂包埋法適用于：不脫鈣骨髓活檢組織，肝、腎穿刺活檢和淋巴結組織等 。 （七）環(huán)己酮 環(huán)己酮無毒， 與苯，二甲苯，氯仿和石蠟混合，可代替無 水乙醇脫水后直接浸蠟，組織塊不會變硬。） 正丁醇：無色液體，脫水能力較弱，可與 水，乙醇和石蠟混合，因此，這種這種脫水的組織塊可直接浸蠟包埋 ， 叔丁醇：無毒， 可與水，乙醇和 二甲苯 混合 ，與正丁醇相比，它不易使組織收縮或變硬 ，而且脫水后可不經透明直接浸蠟， （五）還氧已環(huán) 還氧已環(huán)能于水和乙醇混合，也能溶解石蠟，可代替乙醇進行脫水，也可代替二甲苯進行透明，不引起組織收縮和硬化， 用于制備植物標本較好， 易揮發(fā)，價格昂貴。 （三）異丙醇 是乙醇的良好替代品，不含水，可代替無水乙醇使用，對火棉膠和染料不溶，因此不能用于火棉膠包埋和染料配制。 去除甲醛色素： Verocay 液 脫汞鹽結晶： Lugol 液 脫黑色素： %高錳酸鉀 藍化作用： 稀氨水 組織的脫水 （一 ）乙醇 乙醇脫水的濃度： 70%— 80%— 90%— 95%— 100% 進行糖原和尿酸鹽結晶染色的標本應直接用無水乙醇固定，更換一次無水乙醇脫水即可。使其終濃度為 % 3. 性質溫和，可長期保存組織。 PLP 和 PLPD 液 1. 均含過碘酸鹽 2. 對細胞抗原性和結構保存好， 適用于富含糖類組織的固定 Rossman 液 1. 對糖原固定好 ，固定 1224h，用 95%的乙醇洗 2. 配方：無水乙醇苦味酸飽和液 90ml，甲醛 10ml Zenker 液 1． 用于固定多種組織，對于病毒包涵體固定效果也較好 2. 使細胞核和細胞質染色清晰，常用于三色染色， 對免疫球蛋白染色最好 3. 不適用含血量較多的標本 ，如充血的脾臟和肺梗死等標本 ，且固定后不能用金屬鑷夾取。 3. 固定胚胎組織，神經組織。 4. 常用于糖原和尼氏 體的 固定 5． 不能保存脂類，不適用脂肪染色。 6. 配方：飽和苦味酸水溶液：甲醛水溶液：冰醋酸 =15： 5:： 1 Carnoy 液 1． 有防止乙醇的硬化和收縮作用，增加滲透力， 外膜致密的組織可用其固定 2. 固定速度快， 3mm厚組織塊 1h 內即可固定，大塊組織不超過 4h。 細胞核 著色鮮明，細胞質著色較差。 丙酮 1． 易揮發(fā) ， 易燃的無色液體 ，可與水，醇，氯仿，醚混合 2. 滲透力強，對核的固定差 3. 可使蛋白質沉淀 4. 作用基本與乙醇相同，但對糖原無固定作用 5．廣泛用于酶組織化學中各種酶的固定 乙醇 1. 無色液體，還原劑，可與水無限相溶，有固定兼脫水作用 用于固定的濃度為 80%95% 2． 滲透力弱， 固定速度較慢，易使組織變脆，無水乙醇固定時，穿透速度快，滲透力差，使組織收縮 3.，能沉淀白蛋白，球蛋白，核蛋白 4. 用于糖原的固定 5. 50%以上乙 醇可溶解脂肪和類脂體，并可溶解血紅蛋白，對其他色素也有破壞。 4．為脂類固定劑 5. 適用于線粒體和內質網的固定 6. 為電鏡研究的必須固定劑。 鋨酸 （ 四氧化 鋨 ） ， 劇毒 ，濃度 1%2%，強氧化劑