973項(xiàng)目申報(bào)書(shū)——xxxxcb707400-g木質(zhì)纖維素資源高效生物降解轉(zhuǎn)化中-文庫(kù)吧資料
2025-04-10 23:02本頁(yè)面
【正文】 學(xué)過(guò)程和非酶因子在纖維素降解過(guò)程中作用機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)的纖維素降解復(fù)合體（纖維小體）中新的酶組分進(jìn)行純化、鑒定。采用HPLC、質(zhì)譜等分析手段，定性分析不同預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)纖維素原料抑制物生成種類。申請(qǐng)專利5項(xiàng)左右。構(gòu)建Cohesin和Dockerin的重組表達(dá)體系，獲得純化的重組蛋白；確定代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵成分；解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解機(jī)理，實(shí)現(xiàn)汽爆秸稈的高效水解，得糖率達(dá)到80%以上；建立并改進(jìn)適用于相關(guān)微生物的方便實(shí)用的多套遺傳操作體系；選育多株抗逆性良好、戊糖代謝能力較強(qiáng)的突變菌株或基因工程菌株；構(gòu)建纖維質(zhì)原料的產(chǎn)酶發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，完成不同預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)酵抑制物的生成動(dòng)力學(xué)。建立高通量分析、快速測(cè)定生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成的技術(shù)構(gòu)建23個(gè)特殊環(huán)境微生物元基因組文庫(kù)；篩選、發(fā)現(xiàn)新的與纖維素降解相關(guān)新基因1020個(gè)，克隆510個(gè)不同來(lái)源纖維素酶組分酶基因及非酶蛋白因子基因，確定其酶學(xué)性質(zhì)完成木霉、哈氏嗜纖維菌等不同纖維素酶誘導(dǎo)和抑制條件下差異表達(dá)譜的分析；發(fā)現(xiàn)23個(gè)絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌過(guò)程中起關(guān)鍵作用的基因。研究纖維小體結(jié)構(gòu)域的基因聚類及信息學(xué)分析，對(duì)代表性類型進(jìn)行重組表達(dá)；對(duì)代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵蛋白質(zhì)成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析；利用微生物誘變選育技術(shù)和分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良的突變菌株或基因工程菌株；對(duì)大腸桿菌、酵母等開(kāi)展系統(tǒng)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點(diǎn)以及各種調(diào)節(jié)機(jī)制的變化，深化對(duì)微生物戊糖代謝調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。針對(duì)重要纖維素降解微生物開(kāi)展基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，探索各酶及蛋白因子在纖維素降解過(guò)程中的機(jī)制及協(xié)同作用。經(jīng)費(fèi)比例：14%承擔(dān)單位：清華大學(xué)、華東理工大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：鮑杰學(xué)術(shù)骨干：劉德華、張建安、葉蕊芳、程可可 四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年研究不同生長(zhǎng)期、不同干燥方式、不同產(chǎn)地等對(duì)原料細(xì)胞壁的生物結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的影響。2. 預(yù)處理技術(shù)、生物反應(yīng)與分離過(guò)程的耦合和集成系統(tǒng) 適合預(yù)處理的物料與聯(lián)產(chǎn)反應(yīng)條件：測(cè)量底物預(yù)處理前后的纖維素、半纖維素、木素含量變化、纖維素結(jié)晶度、聚合度變化等參數(shù)，研究不同預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)酵抑制物（乙酸、糠醛、5羥甲基糠醛等）的生成動(dòng)力學(xué)；研究異質(zhì)性底物降解過(guò)程中反應(yīng)的不均一性；研究酶組分耐酸堿性環(huán)境、耐毒性物質(zhì)的適應(yīng)機(jī)理，對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化與理性改造；探索針對(duì)特定預(yù)處理物料的高效酶組分組合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)糖系統(tǒng)；并建立潛在的污染評(píng)價(jià)體系。對(duì)不同反應(yīng)器規(guī)模下的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化和控制。由動(dòng)力學(xué)模型從理論上分析同步糖化發(fā)酵過(guò)程的控制策略。在大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等菌株中構(gòu)建以木糖/阿拉伯糖為唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生產(chǎn)乳酸、琥珀酸、聚羥基脂肪酸酯（PHA）、丁醇、氨基酸、木糖醇等。通過(guò)對(duì)菌體膜運(yùn)輸系統(tǒng)的研究和改造，提高菌體對(duì)底物的利用能力，消除二階段生長(zhǎng)現(xiàn)象，使其能夠同時(shí)利用纖維素水解物中的多種碳源；提高菌體的抗逆及抗不良環(huán)境（耐酸和耐抑制物）的能力；以琥珀酸、乙醇等為代表，通過(guò)異源表達(dá)和代謝阻遏提高菌體合成目標(biāo)化合物的能力。4. 大宗化學(xué)品生產(chǎn)用代謝工程菌的研究和改造 構(gòu)建利用纖維降解組分的工程菌，生產(chǎn)大宗平臺(tái)化合物。3. 利用進(jìn)化或系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)提高相關(guān)工程菌的抗逆性能分析不同預(yù)處理?xiàng)l件下纖維素原料水解液中的主要毒性成分及其含量，通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與經(jīng)典的微生物選育技術(shù)相結(jié)合，獲得對(duì)纖維素水解液中抑制因子的高抗性菌株。首先，對(duì)已成熟的大腸桿菌和酵母遺傳操作體系進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的特點(diǎn)，建立適用于酵母等工業(yè)菌株的位點(diǎn)特異性系統(tǒng)及規(guī)范化操作流程，以去除因分子生物學(xué)操作引入基因組中的抗性標(biāo)記基因；進(jìn)而建立以不同啟動(dòng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的能夠不同水平表達(dá)目標(biāo)基因的表達(dá)體系；直接在酵母中表達(dá)β葡萄糖苷酶等纖維降解酶系組分。經(jīng)費(fèi)比例：14%承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所、清華大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：崔球?qū)W術(shù)骨干：邢新會(huì)、李福利、宋厚輝課題纖維降解組分高效生物轉(zhuǎn)化的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控與改造研究?jī)?nèi)容：1. 微生物戊糖代謝與轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)的解析解析相關(guān)菌株的戊糖代謝相關(guān)基因的功能與作用，解析戊糖運(yùn)輸和代謝機(jī)理；考察葡萄糖和戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并對(duì)其各自轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)行研究，進(jìn)一步解析葡萄糖對(duì)戊糖利用的抑制作用，研究如何解除抑制的方法，為進(jìn)一步提高戊糖的利用效率提供理論支撐；開(kāi)展轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點(diǎn)以及各種調(diào)節(jié)機(jī)制的變化，加深對(duì)戊糖代謝調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)；根據(jù)輔酶工程理念，進(jìn)行分子改造或發(fā)酵工程調(diào)控，改變輔酶特異性，解決氧化還原不平衡問(wèn)題；構(gòu)建高效能的磷酸戊糖途徑，使木糖、阿拉伯糖等戊糖代謝的中間產(chǎn)物進(jìn)入中心代謝途徑并向目標(biāo)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。5. 人工菌群設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素同步糖化產(chǎn)氫以構(gòu)建木質(zhì)纖維素高效發(fā)酵制氫體系為目標(biāo)，研究中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫菌混合發(fā)酵同步糖化產(chǎn)氫過(guò)程，揭示菌群間的相互作用機(jī)制。4. 基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解機(jī)理以木質(zhì)纖維素發(fā)酵制氫為目標(biāo)體系，研究基于中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌C. thermocellum 和C. cellulolyticum強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素生物降解過(guò)程，建立該降解過(guò)程與發(fā)酵制氫匹配的體系。通過(guò)遺傳改造，提高纖維小體的質(zhì)量和數(shù)量，敲除產(chǎn)酸代謝途徑，通過(guò)互補(bǔ)混合培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)五、六碳糖共代謝，提升整體纖維素降解效率，降低生產(chǎn)成本。 對(duì)中高溫產(chǎn)纖維小體模式菌株，包括C. thermocellum 和C. cellulolyticum，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析分析，比較菌株在含有纖維素或者其它碳源培養(yǎng)基中基因的表達(dá)情況，通過(guò)蛋白質(zhì)組分析纖維小體的組成變化，根據(jù)這些組學(xué)數(shù)據(jù)，研究嗜熱厭氧菌纖維小體在功能上的進(jìn)化、表達(dá)和調(diào)控機(jī)理。對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化改造，以期提高對(duì)預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的抑制物的抗逆性，拓寬底物譜，解除產(chǎn)物抑制，最終提高重構(gòu)纖維小體的總體木質(zhì)纖維素降解效率。對(duì)纖維小體骨架蛋白進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)、表達(dá)；同時(shí)利用功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)纖維小體關(guān)鍵酶進(jìn)行篩選并重組表達(dá)，在此基礎(chǔ)上體外構(gòu)建人工纖維小體，并進(jìn)行性狀鑒定。2. 纖維小體的解析、體外重構(gòu)、性能改良，分析各成員在空間上的排列及蛋白－蛋白相互作用，解析酶在空間上的集群與功能上的相互配合對(duì)結(jié)晶纖維素降解效率的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合生理生化驗(yàn)證，研究纖維素降解復(fù)合體，尤其是纖維小體的組成及多樣性。經(jīng)費(fèi)比例：25%承擔(dān)單位：山東大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、天津工業(yè)生物技術(shù)研究所課題負(fù)責(zé)人：曲音波學(xué)術(shù)骨干：田朝光、方詡、汪天虹、嚴(yán)興、張磊課題細(xì)菌酶復(fù)合體纖維素降解轉(zhuǎn)化機(jī)理和纖維小體的解析、重構(gòu)研究?jī)?nèi)容：1. 高溫厭氧纖維素降解細(xì)菌及纖維小體的篩選和多樣性研究，建立不可培養(yǎng)微生物篩選手段，發(fā)掘高溫厭氧纖維素高效降解細(xì)菌，結(jié)合16S rR
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