【正文】 論和實踐基礎(chǔ)。五年預(yù)期目標(biāo)：1）通過闡述植物生物質(zhì)抗生物降解的組成和結(jié)構(gòu)特征，建立起改造纖維生物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)以提高降解效率的理論體系；解析預(yù)處理技術(shù)對提高纖維生物質(zhì)降解性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，提出高效、經(jīng)濟(jì)和實用的預(yù)處理技術(shù)方案；2）研究微生物對天然或預(yù)處理后底物的降解機理，特別是纖維素解聚機理、去結(jié)晶化途徑以及提高纖維素酶的持續(xù)化降解能力的途徑等，探討采用現(xiàn)代系統(tǒng)生物技術(shù)，從復(fù)雜纖維質(zhì)降解多酶體系中，篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的纖維質(zhì)降解酶類；為降解不同的木質(zhì)纖維素資源研制出低成本且高效的復(fù)合酶系；3）選育適于轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)糖分為平臺化合物的微生物，研究其代謝調(diào)控機理與機制，指導(dǎo)構(gòu)建高效代謝工程菌，研究定向轉(zhuǎn)化平臺化合物的過程及相關(guān)產(chǎn)品的利用途徑；進(jìn)而通過對預(yù)處理、產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應(yīng)動力學(xué)、工程學(xué)和方法論的研究，將預(yù)處理技術(shù)、生物反應(yīng)與分離過程耦合起來，提出新的生物煉制技術(shù)方案。4）從木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化角度，構(gòu)建纖維素降解和糖轉(zhuǎn)化利用的數(shù)據(jù)庫，其中包括木質(zhì)纖維素原料組成與結(jié)構(gòu)特征、纖維素降解微生物類群與特性、纖維素酶、半纖維素酶和木素酶及復(fù)合酶系，新型糖代謝的功能微生物等，建立專門的信息共享平臺和網(wǎng)站，為實現(xiàn)大規(guī)模降解轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素資源提供理論、技術(shù)和信息支撐。課題設(shè)置課題植物生物質(zhì)抗生物降解屏障解析與破解途徑探索研究內(nèi)容：1. 植物纖維類生物質(zhì)抗降解屏障的定量解析高通量、快速纖維生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成分析?？疾觳煌A(yù)處理條件下的底物成分變化（如纖維素、半纖維素、木素含量變化）和結(jié)構(gòu)變化（纖維素結(jié)晶度、聚合度變化）以及對可降解性能的影響。 分離新型纖維素降解微生物。經(jīng)費比例：15%承擔(dān)單位：中國科學(xué)院微生物研究所、山東大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：董志揚學(xué)術(shù)骨干：陳冠軍、劉巍峰、盧雪梅、倪金鳳課題真菌游離酶系纖維素降解機理、酶系合成調(diào)控與高效酶系重構(gòu)研究內(nèi)容：1. 真菌纖維素酶合成代謝調(diào)控分子機制研究在基本完成了對斜臥青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工業(yè)高產(chǎn)纖維素酶突變株的全基因組測序的基礎(chǔ)上，采用高通量基因組測序、數(shù)字化全基因組表達(dá)譜分析、熒光差異蛋白表達(dá)分析、RNA沉默、酵母雙雜交等先進(jìn)技術(shù)，通過比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，鑒定出關(guān)鍵節(jié)點基因/蛋白及其在纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能；并利用高效轉(zhuǎn)化和基因評價體系對候選基因進(jìn)行快速功能驗證和評價，解析哪些基因或通路的改變導(dǎo)致了表型（高產(chǎn)纖維素酶突變、抗降解物阻遏）的變化，從而闡明纖維素酶合成的誘導(dǎo)機制、阻遏機理和高產(chǎn)纖維素酶突變的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)酶能力和改進(jìn)酶系組成提供指導(dǎo)。構(gòu)建纖維素酶的高效表達(dá)新系統(tǒng)，培育高效產(chǎn)酶優(yōu)良菌種。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合生理生化驗證，研究纖維素降解復(fù)合體，尤其是纖維小體的組成及多樣性。對關(guān)鍵酶進(jìn)行理性設(shè)計或定向進(jìn)化改造，以期提高對預(yù)處理過程產(chǎn)生的抑制物的抗逆性，拓寬底物譜，解除產(chǎn)物抑制，最終提高重構(gòu)纖維小體的總體木質(zhì)纖維素降解效率。通過遺傳改造，提高纖維小體的質(zhì)量和數(shù)量，敲除產(chǎn)酸代謝途徑，通過互補混合培養(yǎng)實現(xiàn)五、六碳糖共代謝，提升整體纖維素降解效率，降低生產(chǎn)成本。5. 人工菌群設(shè)計實現(xiàn)木質(zhì)纖維素同步糖化產(chǎn)氫以構(gòu)建木質(zhì)纖維素高效發(fā)酵制氫體系為目標(biāo)，研究中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫菌混合發(fā)酵同步糖化產(chǎn)氫過程，揭示菌群間的相互作用機制。首先，對已成熟的大腸桿菌和酵母遺傳操作體系進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)Cre/lox位點特異性重組系統(tǒng)的特點，建立適用于酵母等工業(yè)菌株的位點特異性系統(tǒng)及規(guī)范化操作流程，以去除因分子生物學(xué)操作引入基因組中的抗性標(biāo)記基因；進(jìn)而建立以不同啟動強度的啟動子為基礎(chǔ)的能夠不同水平表達(dá)目標(biāo)基因的表達(dá)體系；直接在酵母中表達(dá)β葡萄糖苷酶等纖維降解酶系組分。4. 大宗化學(xué)品生產(chǎn)用代謝工程菌的研究和改造 構(gòu)建利用纖維降解組分的工程菌，生產(chǎn)大宗平臺化合物。在大腸桿菌、運動發(fā)酵單胞菌等菌株中構(gòu)建以木糖/阿拉伯糖為唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生產(chǎn)乳酸、琥珀酸、聚羥基脂肪酸酯（PHA）、丁醇、氨基酸、木糖醇等。對不同反應(yīng)器規(guī)模下的發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化和控制。經(jīng)費比例：14%承擔(dān)單位：清華大學(xué)、華東理工大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：鮑杰學(xué)術(shù)骨干：劉德華、張建安、葉蕊芳、程可可四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年研究不同生長期、不同干燥方式、不同產(chǎn)地等對原料細(xì)胞壁的生物結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的影響。研究纖維小體結(jié)構(gòu)域的基因聚類及信息學(xué)分析，對代表性類型進(jìn)行重組表達(dá)；對代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵蛋白質(zhì)成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析；利用微生物誘變選育技術(shù)和分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良的突變菌株或基因工程菌株；對大腸桿菌、酵母等開展系統(tǒng)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點以及各種調(diào)節(jié)機制的變化，深化對微生物戊糖代謝調(diào)控機理的認(rèn)識。構(gòu)建Cohesin和Dockerin的重組表達(dá)體系，獲得純化的重組蛋白；確定代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵成分；解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強化的木質(zhì)纖維素高效降解機理，實現(xiàn)汽爆秸稈的高效水解，得糖率達(dá)到80%以上；建立并改進(jìn)適用于相關(guān)微生物的方便實用的多套遺傳操作體系；選育多株抗逆性良好、戊糖代謝能力較強的突變菌株或基因工程菌株；構(gòu)建纖維質(zhì)原料的產(chǎn)酶發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵過程的動力學(xué)模型，完成不同預(yù)處理條件下發(fā)酵抑制物的生成動力學(xué)。采用HPLC、質(zhì)譜等分析手段，定性分析不同預(yù)處理條件下木質(zhì)纖維素原料抑制物生成種類。分別建立中高溫/中溫解纖維梭菌強化的木質(zhì)纖維素高效降解汽爆玉米秸稈工藝；選擇與木質(zhì)纖維素降解菌生長條件匹配的高效產(chǎn)氫菌株；研究各種產(chǎn)氫菌株的特性，優(yōu)化其培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝條件；混合培養(yǎng)產(chǎn)氫菌株與產(chǎn)纖維小體梭菌，研究各組合菌株的協(xié)同度。獲得特定菌株降解纖維素的最佳條件及作用范圍，發(fā)現(xiàn)新的酶組分并闡述其降解性質(zhì)；獲得熱纖梭菌不同碳源的轉(zhuǎn)錄譜，以及一些纖維小體表達(dá)調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因，并初步闡明其調(diào)控機理。專利5項左右。通過對纖維素酶生產(chǎn)菌株合成代謝途徑分子改造，優(yōu)化纖維素酶各組分及非酶因子組成結(jié)構(gòu)，挖掘影響絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌效率的調(diào)控蛋白或基因，探索絲狀真菌纖維素酶的高效分泌機制，闡明各種蛋白質(zhì)組分協(xié)同效應(yīng)的作用機制。繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動力學(xué)與過程特性研究，非均相酶解與發(fā)酵過程的優(yōu)化控制，木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究，預(yù)處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評價，預(yù)處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過程的節(jié)能和酶再生利用。完成動力學(xué)模型的理論分析以及同步糖化發(fā)酵過程的控制策略；完成針對特定預(yù)處理物料的高效酶組分組合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)糖系統(tǒng)；完成高粘度多相流體系的混合與傳遞過程的數(shù)學(xué)模擬、生物轉(zhuǎn)化與代謝過程中酶與細(xì)胞狀態(tài)的定量表征與調(diào)控；完成同步糖化與發(fā)酵過程中酶與細(xì)胞對酸堿性環(huán)境和有毒性物質(zhì)的適應(yīng)機理，并完成對其進(jìn)行定向馴化與改造；完成以工程手段降低預(yù)處理過程的蒸汽能耗、同步糖化與發(fā)酵過程的機械能耗和乙醇精餾過程能耗目標(biāo)發(fā)表SCI論文3545篇；申請發(fā)明專