【正文】 論和實(shí)踐基礎(chǔ)。五年預(yù)期目標(biāo)：1）通過(guò)闡述植物生物質(zhì)抗生物降解的組成和結(jié)構(gòu)特征，建立起改造纖維生物質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)以提高降解效率的理論體系；解析預(yù)處理技術(shù)對(duì)提高纖維生物質(zhì)降解性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，提出高效、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的預(yù)處理技術(shù)方案；2）研究微生物對(duì)天然或預(yù)處理后底物的降解機(jī)理，特別是纖維素解聚機(jī)理、去結(jié)晶化途徑以及提高纖維素酶的持續(xù)化降解能力的途徑等，探討采用現(xiàn)代系統(tǒng)生物技術(shù)，從復(fù)雜纖維質(zhì)降解多酶體系中，篩選和發(fā)現(xiàn)新的高效、耐逆、適合工業(yè)要求的纖維質(zhì)降解酶類(lèi)；為降解不同的木質(zhì)纖維素資源研制出低成本且高效的復(fù)合酶系；3）選育適于轉(zhuǎn)化纖維質(zhì)糖分為平臺(tái)化合物的微生物，研究其代謝調(diào)控機(jī)理與機(jī)制，指導(dǎo)構(gòu)建高效代謝工程菌，研究定向轉(zhuǎn)化平臺(tái)化合物的過(guò)程及相關(guān)產(chǎn)品的利用途徑；進(jìn)而通過(guò)對(duì)預(yù)處理、產(chǎn)酶、酶解和發(fā)酵的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、工程學(xué)和方法論的研究，將預(yù)處理技術(shù)、生物反應(yīng)與分離過(guò)程耦合起來(lái)，提出新的生物煉制技術(shù)方案。4）從木質(zhì)纖維素生物降解轉(zhuǎn)化角度，構(gòu)建纖維素降解和糖轉(zhuǎn)化利用的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括木質(zhì)纖維素原料組成與結(jié)構(gòu)特征、纖維素降解微生物類(lèi)群與特性、纖維素酶、半纖維素酶和木素酶及復(fù)合酶系，新型糖代謝的功能微生物等，建立專(zhuān)門(mén)的信息共享平臺(tái)和網(wǎng)站，為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模降解轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素資源提供理論、技術(shù)和信息支撐。課題設(shè)置課題植物生物質(zhì)抗生物降解屏障解析與破解途徑探索研究?jī)?nèi)容：1. 植物纖維類(lèi)生物質(zhì)抗降解屏障的定量解析高通量、快速纖維生物質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成分析?？疾觳煌A(yù)處理?xiàng)l件下的底物成分變化（如纖維素、半纖維素、木素含量變化）和結(jié)構(gòu)變化（纖維素結(jié)晶度、聚合度變化）以及對(duì)可降解性能的影響。 分離新型纖維素降解微生物。經(jīng)費(fèi)比例：15%承擔(dān)單位：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、山東大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：董志揚(yáng)學(xué)術(shù)骨干：陳冠軍、劉巍峰、盧雪梅、倪金鳳課題真菌游離酶系纖維素降解機(jī)理、酶系合成調(diào)控與高效酶系重構(gòu)研究?jī)?nèi)容：1. 真菌纖維素酶合成代謝調(diào)控分子機(jī)制研究在基本完成了對(duì)斜臥青霉原始菌株和抗降解物阻遏的工業(yè)高產(chǎn)纖維素酶突變株的全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，采用高通量基因組測(cè)序、數(shù)字化全基因組表達(dá)譜分析、熒光差異蛋白表達(dá)分析、RNA沉默、酵母雙雜交等先進(jìn)技術(shù)，通過(guò)比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等方法，鑒定出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因/蛋白及其在纖維素酶表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的位置和功能；并利用高效轉(zhuǎn)化和基因評(píng)價(jià)體系對(duì)候選基因進(jìn)行快速功能驗(yàn)證和評(píng)價(jià)，解析哪些基因或通路的改變導(dǎo)致了表型（高產(chǎn)纖維素酶突變、抗降解物阻遏）的變化，從而闡明纖維素酶合成的誘導(dǎo)機(jī)制、阻遏機(jī)理和高產(chǎn)纖維素酶突變的分子基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)酶能力和改進(jìn)酶系組成提供指導(dǎo)。構(gòu)建纖維素酶的高效表達(dá)新系統(tǒng)，培育高效產(chǎn)酶優(yōu)良菌種。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)合生理生化驗(yàn)證，研究纖維素降解復(fù)合體，尤其是纖維小體的組成及多樣性。對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行理性設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化改造，以期提高對(duì)預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的抑制物的抗逆性，拓寬底物譜，解除產(chǎn)物抑制，最終提高重構(gòu)纖維小體的總體木質(zhì)纖維素降解效率。通過(guò)遺傳改造，提高纖維小體的質(zhì)量和數(shù)量，敲除產(chǎn)酸代謝途徑，通過(guò)互補(bǔ)混合培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)五、六碳糖共代謝，提升整體纖維素降解效率，降低生產(chǎn)成本。5. 人工菌群設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素同步糖化產(chǎn)氫以構(gòu)建木質(zhì)纖維素高效發(fā)酵制氫體系為目標(biāo)，研究中高溫產(chǎn)纖維小體梭菌與產(chǎn)氫菌混合發(fā)酵同步糖化產(chǎn)氫過(guò)程，揭示菌群間的相互作用機(jī)制。首先，對(duì)已成熟的大腸桿菌和酵母遺傳操作體系進(jìn)行改進(jìn)，根據(jù)Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的特點(diǎn)，建立適用于酵母等工業(yè)菌株的位點(diǎn)特異性系統(tǒng)及規(guī)范化操作流程，以去除因分子生物學(xué)操作引入基因組中的抗性標(biāo)記基因；進(jìn)而建立以不同啟動(dòng)強(qiáng)度的啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的能夠不同水平表達(dá)目標(biāo)基因的表達(dá)體系；直接在酵母中表達(dá)β葡萄糖苷酶等纖維降解酶系組分。4. 大宗化學(xué)品生產(chǎn)用代謝工程菌的研究和改造 構(gòu)建利用纖維降解組分的工程菌，生產(chǎn)大宗平臺(tái)化合物。在大腸桿菌、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等菌株中構(gòu)建以木糖/阿拉伯糖為唯一碳源的工程菌，并利用工程菌生產(chǎn)乳酸、琥珀酸、聚羥基脂肪酸酯（PHA）、丁醇、氨基酸、木糖醇等。對(duì)不同反應(yīng)器規(guī)模下的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化和控制。經(jīng)費(fèi)比例：14%承擔(dān)單位：清華大學(xué)、華東理工大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：鮑杰學(xué)術(shù)骨干：劉德華、張建安、葉蕊芳、程可可四、年度計(jì)劃研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年研究不同生長(zhǎng)期、不同干燥方式、不同產(chǎn)地等對(duì)原料細(xì)胞壁的生物結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成的影響。研究纖維小體結(jié)構(gòu)域的基因聚類(lèi)及信息學(xué)分析，對(duì)代表性類(lèi)型進(jìn)行重組表達(dá)；對(duì)代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵蛋白質(zhì)成分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析；利用微生物誘變選育技術(shù)和分子生物學(xué)手段選育優(yōu)良的突變菌株或基因工程菌株；對(duì)大腸桿菌、酵母等開(kāi)展系統(tǒng)分析、代謝控制分析和代謝流向分析，研究菌株的代謝途徑、代謝節(jié)點(diǎn)以及各種調(diào)節(jié)機(jī)制的變化，深化對(duì)微生物戊糖代謝調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)。構(gòu)建Cohesin和Dockerin的重組表達(dá)體系，獲得純化的重組蛋白；確定代表性纖維素降解體系的關(guān)鍵成分；解析基于纖維小體產(chǎn)生菌生物強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解機(jī)理，實(shí)現(xiàn)汽爆秸稈的高效水解，得糖率達(dá)到80%以上；建立并改進(jìn)適用于相關(guān)微生物的方便實(shí)用的多套遺傳操作體系；選育多株抗逆性良好、戊糖代謝能力較強(qiáng)的突變菌株或基因工程菌株；構(gòu)建纖維質(zhì)原料的產(chǎn)酶發(fā)酵、同步糖化發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，完成不同預(yù)處理?xiàng)l件下發(fā)酵抑制物的生成動(dòng)力學(xué)。采用HPLC、質(zhì)譜等分析手段，定性分析不同預(yù)處理?xiàng)l件下木質(zhì)纖維素原料抑制物生成種類(lèi)。分別建立中高溫/中溫解纖維梭菌強(qiáng)化的木質(zhì)纖維素高效降解汽爆玉米秸稈工藝；選擇與木質(zhì)纖維素降解菌生長(zhǎng)條件匹配的高效產(chǎn)氫菌株；研究各種產(chǎn)氫菌株的特性，優(yōu)化其培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝條件；混合培養(yǎng)產(chǎn)氫菌株與產(chǎn)纖維小體梭菌，研究各組合菌株的協(xié)同度。獲得特定菌株降解纖維素的最佳條件及作用范圍，發(fā)現(xiàn)新的酶組分并闡述其降解性質(zhì)；獲得熱纖梭菌不同碳源的轉(zhuǎn)錄譜，以及一些纖維小體表達(dá)調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵基因，并初步闡明其調(diào)控機(jī)理。專(zhuān)利5項(xiàng)左右。通過(guò)對(duì)纖維素酶生產(chǎn)菌株合成代謝途徑分子改造，優(yōu)化纖維素酶各組分及非酶因子組成結(jié)構(gòu)，挖掘影響絲狀真菌纖維素酶合成、修飾、分泌效率的調(diào)控蛋白或基因，探索絲狀真菌纖維素酶的高效分泌機(jī)制，闡明各種蛋白質(zhì)組分協(xié)同效應(yīng)的作用機(jī)制。繼續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵、酶水解和乙醇發(fā)酵體系的動(dòng)力學(xué)與過(guò)程特性研究，非均相酶解與發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制，木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化過(guò)程放大的工程學(xué)基礎(chǔ)研究，預(yù)處理體系與生物煉制聯(lián)產(chǎn)系統(tǒng)的綜合評(píng)價(jià)，預(yù)處理、同步糖化與發(fā)酵和產(chǎn)物分離過(guò)程的節(jié)能和酶再生利用。完成動(dòng)力學(xué)模型的理論分析以及同步糖化發(fā)酵過(guò)程的控制策略；完成針對(duì)特定預(yù)處理物料的高效酶組分組合的轉(zhuǎn)化產(chǎn)糖系統(tǒng)；完成高粘度多相流體系的混合與傳遞過(guò)程的數(shù)學(xué)模擬、生物轉(zhuǎn)化與代謝過(guò)程中酶與細(xì)胞狀態(tài)的定量表征與調(diào)控；完成同步糖化與發(fā)酵過(guò)程中酶與細(xì)胞對(duì)酸堿性環(huán)境和有毒性物質(zhì)的適應(yīng)機(jī)理，并完成對(duì)其進(jìn)行定向馴化與改造；完成以工程手段降低預(yù)處理過(guò)程的蒸汽能耗、同步糖化與發(fā)酵過(guò)程的機(jī)械能耗和乙醇精餾過(guò)程能耗目標(biāo)發(fā)表SCI論文3545篇；申請(qǐng)發(fā)明專(zhuān)