三、基因工程的基本條件-工具酶和細(xì)胞-文庫(kù)吧資料
2025-01-27 22:06本頁(yè)面
【正文】 響的酶有 Bcl I、 MboI等，但 BamH I、 Bgl II、 Sau3A I不受影響 大腸桿菌中的 dcm甲基化酶在 5‘ CCAGG3’或 5‘ CCTGG3’序列 中的 胞嘧啶 C5位 上引入甲基， 受其影響的酶有 EcoR II等 哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在 5‘ CG3’序列中的 C5位 上引入甲基 限制性核酸內(nèi)切酶 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 酶活性單位：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng) 1 小時(shí)，完全水解 1 mg 標(biāo) 準(zhǔn)λDNA所需的酶活性定為 1U 酶用量： 當(dāng) DNA樣品確定后，為完全切割此 DNA，酶的用量視酶的催化活性而定。如 BamH I、Bgl Ⅱ 、 Bcl I、 Xho Ⅱ 等 同尾酶 (Isocaudamers） 5’G?GATCC3’ 3’CCTAG?G5’ BamH I Bcl I 5’T?GATCA3’ 3’ACTAG?T5’ 5’A?GATCT3’ 3’TCTAG?A5’ Bgl Ⅱ 5’U?GATCY3’ 3’YCTAG?U5’ Xho Ⅱ U代表嘌呤； Y代表嘧啶。 如 Xma I 和 Sma I。 如 Hind Ⅲ 和 Hsu I。 PvuII等產(chǎn)生的平頭末端 5‘ … GCTCAGCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCGACCTC … 5’ PvuII 37 ℃ 5‘ … GCTCAGOH PCTGGAG … 3’ 3‘ … CGAGTCP OHGACCTC … 5’ 識(shí)別位點(diǎn)的序列相同的限制性?xún)?nèi)切酶。 ② 5’末端標(biāo)記 凸出的 5’末端 可用 DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。 這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 屬名 種名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感桿菌 d株 同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶 II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 識(shí)別雙鏈 DNA分子中 4 8對(duì)堿基的特定序列 大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè) 識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)型 回文結(jié)構(gòu) 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoR I的識(shí)別序列 EcoR I的切割位點(diǎn) EcoRI等產(chǎn)生的 5‘粘性末端 5‘ … GCTGAATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAAGCTC … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘ … GCTGOH PAATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAAP OHGCTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘ … GCTG AATTCGAG … 3’ 3‘ … CGACTTAA GCTC … 5’ OH P OH P PstI等產(chǎn)生的 3‘粘性末端 5‘ … GCTCTGCAGGAG … 3’ 3‘ … CGAGACGTCCTC … 5’ PstI 37 ℃ 5‘ … GCTCTGCAOH PGGAG … 3’ 3‘ … CGAGP OHACGTCCTC … 5’ 退火 47 ℃ 5‘ … GCTCTGCA GGAG … 3’ 3‘ … CGAG ACGTCCTC … 5’ OH P OH P ①連接便利 粘性末端的意義 i）不同的 DNA雙鏈： 只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。 分離的第一個(gè)酶是 Hind Ⅱ П型限制性?xún)?nèi)切酶 限制 修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩種不同酶分子組成 ,分子質(zhì)量小 ,能識(shí)別 DNA的特殊序列 ,種類(lèi)多 ,在基因工程中起重要作用 . III類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶 在完全肯定的位點(diǎn)切割 DNA，但反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和 SAM（ S腺苷蛋氨酸）。 （ 3）作用機(jī)理 在距離特異性識(shí)別位點(diǎn)約 1000— 1500 bp處 隨機(jī) 切開(kāi)一條 單鏈 。 未甲基化修飾的特異序列。 （ 2）修飾（ Modification） ① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤 N6位置引入甲基 ② Dcm甲基化酶 CCAGG或 CCTGG序列在第二個(gè) C上C5位置上引入甲基 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的類(lèi)型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修飾 多功能 單功能 雙功能 蛋白結(jié)構(gòu) 異源三聚體 同源二聚體 異源二聚體 輔助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg2+ SAM Mg2+ 識(shí)別序列 TGAN8TGCT 旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位點(diǎn) 距識(shí)別序列 1kb處 識(shí)別序列內(nèi)或附近 距識(shí)別序列下游 隨機(jī)性切割 特異性切割 2426bp處 首先由 M. Meselson和 R. Yuan在 1968年從大腸桿菌 B株 和 K株 分離的。Geic Engineering 3 基因工程的基本條件 C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞 B 用于 基因克隆的載體 A 用于核酸操作的工具酶 A 用于核酸操作的工具酶 3 基因工程的基本條件 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修飾酶 限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能 識(shí)別雙鏈 DNA分子中的特定序列，并切割 DNA雙鏈 主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái) DNA的入侵 細(xì)菌的限制與修飾作用 hsd R： 編碼限制性核酸內(nèi)切酶 hsd M： 編碼限制性甲基化酶 hsd S： 編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)
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