層析分離純化技術ppt課件-文庫吧資料
2025-01-27 19:26本頁面
【正文】 9 7 6 6 5 5 3 6 3 1 2 2 1 4 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 k D a Lane Sample 1 MW Standard 2 Bioreactor sup (reduced) 3 Buffer exchanged material (reduced) 4 Partially purified IgM from cation step (reduced) 5 Highly purified IgM from anion step (reduced) 6 MW Standard 7 Bioreactor sup (non reduced) 8 Buffer exchanged material (non reduced) 9 Partially purified IgM from cation step (nonreduced) 10 Highly purified IgM from anion step (nonreduced) IEX——IEX MacroPrep High Q和 High S兩步純化 IgM 工藝路線選擇 IEX——CHT UNOsphere S和 CHT羥基磷灰石兩步純化鼠 mAb IgG 工藝路線選擇 0 .05 0. 01 00 . 0% B u ff e r B12341 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 310 .0 00 .2 50 .5 00 .7 51 .0 01 .2 50 .02 .55 .07 .51 0. 01 2. 50 0: 0 0: 00 0 0: 1 0: 00 0 0: 2 0: 00 0 0: 3 0: 00F ra c ti on sH r: M in :S e c pHAUUNOsphere S初純 0 .05 0. 01 00 . 0% B u ff e r B1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 0. 0 500 .0 0 00 .0 5 00 .1 0 00 .1 5 00 .2 0 00 .2 5 00 .3 0 00 .3 5 00 .4 0 0 10 . 00 .01 0. 02 0. 03 0. 04 0. 05 0. 06 0. 07 0. 08 0. 09 0. 01 00 . 00 0: 0 0: 00 0 0: 1 0: 00 0 0: 2 0: 00 0 0: 3 0: 00 0 0: 4 0: 00 0 0: 5 0: 00F ra c ti on sH r: M in :S e c m S/ c mAUCM UNOsphere PA CHT CHT IEX——CHT UNOsphere S和 CHT羥基磷灰石兩步純化鼠 mAb IgG 工藝路線選擇 CHT精純 Affinity——IEX——CHT 純化 mAb 工藝路線選擇 ? 原理 ? Protein A to remove the bulk of HCP, DNA, endotoxin, virus. ? UNOsphere Q to remove retrovirus, polish DNA, endotoxin, and HCP. ? CHT to remove leached protein A and IgG aggregates, polish other contaminants. Affinity——IEX——CHT 純化 mAb 工藝路線選擇 Protein A CHT UNOsphere Q 4 1 2 3 1 2 3 4 5 2 4 5 0 S HPSEC BioSilect SEC 4005 50mM Hepes NaCl 2M urea, pH 7 CHT ——親和： 純化轉(zhuǎn)基因羊奶中的重組人 α1抗胰蛋白酶 工藝路線選擇 圖 1 CHTI柱純化 α1AT。 可分離各種單糖、糖醇、寡糖、有機酸以及小肽和氨基酸等等物質(zhì)。 ? 堿性蛋白質(zhì)，如 IgG以陽離子交換作用為主，其載量和保留受 NaCl影響顯著 注： 對于帶負電荷的酸性蛋白質(zhì)，無論樣品是否含有NaCl，都對上樣時的吸附載量和保留無影響，這意味著可以將捕獲階段獲得的中間體樣品無需脫鹽處理即可上樣到 CHT上進行高分辨率中間純化 羥基磷灰石（ CHT） 混合保留機制 Type I ?由于具有更高的表面積， I型具有更高的蛋白載量，而且具有更大的保留 . Type II ?由于具有大孔結構， II 型具有更高的核酸載量，能分離單鏈和雙鏈 DNA，和超螺旋與非超螺旋的 DNA ?白蛋白不能與 II型結合，對于一些含白蛋白的抗體樣品，II型分離純化更有利 . ?大分子重組疫苗的中間純化和大規(guī)模制備 如何選擇類型 羥基磷灰石（ CHT） 分離純化原理與操作參數(shù)選擇 羥基磷灰石（ CHT） 影響蛋白質(zhì)色譜行為的操作參數(shù)： CHT類型 NaCl濃度 PB緩沖液濃度梯度 雙梯度洗脫 PB緩沖液梯度含不同 NaCl濃度 緩沖液 pH值 雙梯度洗脫模型 先以 0500mM NaCl，再以 0500mM 磷酸鉀 不同類型 CHT陶瓷羥基磷灰石在不同 pH下不同蛋白質(zhì)的保留時間（ min） 羥基磷灰石（ CHT） ? 基于生物分子表面疏水性不同而達到分離的技術 ? 疏水作用來自于分子的水化結構，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結構，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團暴露于分子外表面，從而可與疏水介質(zhì)結合 ? 不同離子的疏水性 – Anions: SO42 Cl Br NO3 ClO4 I SCN – Cations: Mg2+ Li+ Na+ K+ NH4+ ? 蛋白質(zhì)以高濃度鹽溶液結合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫 原理 疏水層析 MacroPrep Methyl HIC MacroPrep tButyl HIC 產(chǎn)品 操作參數(shù)選擇 疏水層析 ?疏水介質(zhì)選擇：甲基，丁基，苯基疏水 疏水性強的蛋白質(zhì)：甲基，丁基 疏水性弱的蛋白質(zhì)：丁基，苯基 ?鹽：硫酸銨，醋酸銨等等 ?緩沖體系和 pH ?洗脫梯度 Definition Separation
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