生物化學(xué)和分子生物學(xué)(1)-文庫吧資料
2025-01-24 02:14本頁面
【正文】 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克隆） 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 重組體克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)化后的克隆群體： 陽性重組子的 篩選與 鑒定 ? 遺傳檢測法 (根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選 ) 插入失活法 α互補(bǔ)法 ? 2. 限制性酶切法 ? 3. PCR法 ? ? 法 ? 6. 核苷酸序列測定法 遺傳檢測法 ? 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。 ?脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法：將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 ?激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。將 DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和 NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將 DNA包裹在沉淀中。 轉(zhuǎn)化方法 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞系統(tǒng) 永生細(xì)胞系 細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記 對抗某種藥物 ?電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個數(shù)量級。 ? 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法 (如電擊法 ,CaCl2等化學(xué)試劑法 )的處理后 ,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變 ,成為能允許外源 DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 轉(zhuǎn) 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 重組體的轉(zhuǎn)化 宿主菌或受體細(xì)胞 ②真核系統(tǒng) 酵母菌酵母 昆蟲細(xì)胞 哺乳動物細(xì)胞 ①原核系統(tǒng) 大腸桿菌 枯草桿菌 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 受體細(xì)胞的選擇 限制缺陷型 : 避免修飾和降解 重組缺陷型： 避免重組整合 轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性 遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選 感染缺陷型： 防止感染 感受態(tài)細(xì)胞（ petent cell） ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker,即一段人工合成的含有多種限制酶切點的小分子 DNA片段 ,約 10~20個核苷酸， ）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 ? 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的 339。 載體 DNA與目的基因的連接 （二）人工接尾法： ? 即同聚物加尾連接法。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入 DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 接 載體和目的基因的 連接 ? 即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的 DNA分子。突出粘性末端三種情況。 ? 由限制酶切斷后的末端可形成平端、 339。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克隆） 表（達(dá)目的基因） “縱向”
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