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綠色銀光蛋白ppt課件-文庫(kù)吧資料

2025-01-21 08:35本頁(yè)面
  

【正文】 。 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上 , 研究人員設(shè)計(jì)了FRET 依賴的 Ca 2+ 敏感指示劑 , 該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) , 通過(guò)改變兩個(gè) GFP 之間的距離 , 可增加 FRET。它消除了 GFP 分子在絕對(duì)濃度、細(xì)胞的厚度、激發(fā)源的能量度以及檢測(cè)的絕對(duì)效率等的影響。兩個(gè)分子間微小的線性或空間定位關(guān)系的破壞可以強(qiáng)烈地改變能量轉(zhuǎn)移的效率。它能夠利用GFP及其突變體青色熒光蛋白( CFP)、黃色熒光 蛋白 ( YFP)等,定時(shí)、定量、定位、無(wú)損傷地在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)大分子構(gòu)象變化、蛋白之間相互作用、信號(hào)傳遞途徑。結(jié)果證明加入底物的一組顯示出比對(duì)照組更強(qiáng)的熒光,由此提出 splitGFP在觀察蛋白構(gòu)型變化中的應(yīng)用。 Hu等提出了雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)( BiFC)的概念,用互補(bǔ)的熒光片斷標(biāo)記不同蛋白來(lái)研究bZIP和 Rel轉(zhuǎn)錄因子家族的相互作用,確定了相互作用位置,信號(hào)傳遞對(duì)作用位點(diǎn)的調(diào)節(jié)等。將標(biāo)記蛋白在某個(gè)位點(diǎn)打開(kāi),用片斷分別標(biāo)記兩個(gè)蛋白。另外,細(xì)胞內(nèi) GFP的檢測(cè)也比較簡(jiǎn)單,如利用紫外燈、熒光顯微鏡、熒光激活細(xì)胞分選儀等,現(xiàn)有報(bào)道利用實(shí)時(shí)定量 PCR進(jìn)行 GFP熒光定量測(cè)定的方法。并且, GFP的某些位點(diǎn)可以耐受整段蛋白的插入,在結(jié)合金屬離子的黃色熒光蛋白( Yellow Fluorescent Protein, YFP, GFP的突變體)中 145位插入鋅指結(jié)構(gòu)能使熒光強(qiáng)度多倍提高。而其最顯著的特點(diǎn)是除了氧氣之外,不需要其他輔酶,不需底物。由于存在兩個(gè)吸收峰 , 野生型 GFP 可以被標(biāo)準(zhǔn)的長(zhǎng)波紫外 源和異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate , FITC) 所激發(fā)。 ? 1. 兩個(gè)野生型 GFP吸收紫外光和藍(lán)光,發(fā)射綠光,在 395 nm 出現(xiàn)一個(gè)最大吸收峰 , 在 470 nm 出現(xiàn)一個(gè)小的吸收。翻譯出的蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后 , 在 O 2 存在下 , 分子內(nèi)第 67 位甘氨酸的酰胺對(duì)第 65 位絲氨酸的羧基的親核攻擊形成第 5 位碳原子咪唑基 , 第 66 位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應(yīng)之后 , 導(dǎo)致芳香團(tuán)與咪唑基結(jié)合。實(shí)驗(yàn)表明 GFP 熒光產(chǎn)生的前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性 , 去除 N 端 6 個(gè)氨基酸或 C 端 9 個(gè)氨基酸 ,GFP 均會(huì)失去熒光。 GFP結(jié)構(gòu) GFP結(jié)構(gòu) ?桶的頂部由 3 個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 底部由一個(gè)短的垂直片段覆蓋 , 對(duì)熒光活性
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