hplc常見問題和對(duì)策-文庫吧資料
2025-01-20 21:37本頁面
【正文】 常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解。水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān)。 二 固定相穩(wěn)定性 固定相的穩(wěn)定性都是有限的，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會(huì)慢慢水解。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時(shí)間的漂移。通常平衡需要1020個(gè)柱體積的流動(dòng)相，但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑（如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長的時(shí)間來平衡色譜柱。事實(shí)上，保留時(shí)間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解），色譜柱污染（由樣品或流動(dòng)相所致）等。將此兩種情況區(qū)分開來對(duì)找到問題的原因往往很有幫助。 ⑤用強(qiáng)極性溶液清洗系統(tǒng) ⑥清洗檢測器，在檢測器后面安裝背景壓力調(diào)節(jié)器 ⑦用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池 ⑧更換燈 ⑨更換色譜柱 ⑩維修或更換混合器，在流動(dòng)相不走梯度時(shí)，建議不使用泵的混合裝置 保留時(shí)間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時(shí)間漂移和保留時(shí)間波動(dòng)。 ②檢查流動(dòng)相的組成。如有必要，更換密封。 ②流動(dòng)相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成 ③流動(dòng)相各溶劑不相溶 ④檢測器/記錄儀電子元件的問題 ⑤系統(tǒng)內(nèi)有氣泡 ⑥檢測器內(nèi)有氣泡 ⑦流通池污染（即使是極少的污染物也會(huì)產(chǎn)生噪音。 采用精密級(jí)穩(wěn)壓電源。如有必要，更換泵密封。沖洗系統(tǒng)以除去檢測器或泵中的空氣。 ④溫度影響（柱溫過高，檢測器未加熱） ⑤在同一條線上有其他電子設(shè)備（偶然噪聲） ⑥泵振動(dòng) 。 原因 ①在流動(dòng)相、檢測器或泵中有空氣（尖銳峰） ②漏液 。 ⑩將波長調(diào)整至最大吸收波長處。 ⑨重新設(shè)定基線。使用高品質(zhì)的化學(xué)試劑及HPLC級(jí)的溶劑 ⑧改變分析條件。使用離子對(duì)試劑、緩沖鹽更應(yīng)注意平衡柱。為避免這個(gè)問題可定期檢查流動(dòng)相組成及流速。參考檢測器手冊(cè)更換流通池窗。如有需要，可以用1N的硝酸。流動(dòng)相在使用前進(jìn)行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。 ⑩檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處。 ⑨使用循環(huán)溶劑，不提倡。） ③流通池被污染或有氣體 ④檢測器出口阻塞。） ②流動(dòng)相不均勻。（即使是很小的溫度變化都會(huì)引起基線的波動(dòng)。這些提醒我們，如果想得到穩(wěn)定可靠的分離結(jié)果，色譜柱的溫度變化是不可忽視的。或許讀者對(duì)這個(gè)現(xiàn)象會(huì)有簡單的解釋。在理想梯度洗脫中，每個(gè)峰都應(yīng)該在相同的環(huán)境中出來而且以相同的速度通過柱子，最后得到相同的峰寬。這種現(xiàn)象和梯度洗脫中有種情況是相對(duì)的，就是在一開始使用弱極性溶劑小流速后用強(qiáng)極性大流速。前段的溫度比尾部的溫度高，所以前段走的快。雖然由于比例不同我們無法看出，其實(shí)圖35中所有對(duì)應(yīng)成份的峰面積都是不變的。在77℃時(shí)后一個(gè)峰變形很大以至于會(huì)認(rèn)為它是兩個(gè)成份或者認(rèn)為柱子有了死體積。 當(dāng)流動(dòng)相和柱子之間的溫差增大時(shí)，由溫度不平衡而導(dǎo)致的峰變形就會(huì)加劇。圖3中的上面一個(gè)色譜圖就是增加了預(yù)熱器使峰形得到改善。把溶劑瓶、泵、自動(dòng)進(jìn)樣器加熱至與柱溫相同是不現(xiàn)實(shí)的，所以溶劑預(yù)熱器是最好的選擇。柱子里的溫度變化將會(huì)影響峰形。（這篇文章里的色譜圖不是按同一個(gè)y軸比例來畫的，所以峰高的變化沒有表示出來） 不用平衡的流動(dòng)相充分的沖洗柱子會(huì)導(dǎo)致化學(xué)不平衡狀態(tài)，但是當(dāng)柱子在程序升溫的環(huán)境中我們?cè)鯓哟_定不平衡問題呢？答案取決于柱子中的流動(dòng)相，如果柱子是在室溫條件下，溶劑瓶、泵和自動(dòng)進(jìn)樣器也在室溫下，那么整個(gè)系統(tǒng)中的溫度就應(yīng)該是穩(wěn)定的。當(dāng)溫度變化時(shí)除了選擇性和保留時(shí)間的變化之外，峰寬也會(huì)發(fā)生變化。（），當(dāng)流動(dòng)相從100%的B溶劑換回到5%的B溶劑時(shí)，在進(jìn)行下一次梯度變換之前如果系統(tǒng)沒有平衡,那么保留時(shí)間的重現(xiàn)性就會(huì)很差。當(dāng)一次梯度洗脫分離完成后，一定要用1015倍柱體積的流動(dòng)相來沖洗柱子以恢復(fù)柱子的平衡。隔絕色譜柱也可以避免結(jié)果受環(huán)境溫度影響。 如果沒有柱溫箱，最有效的辦法就是將色譜柱隔絕在一個(gè)溫度波動(dòng)最小的地方。在直接加熱型柱溫箱中色譜柱是被夾在金屬加熱器中或被加熱器包裹起來；而在空氣傳熱型的柱溫箱和氣相色譜柱溫箱很相像，色譜柱是被懸掛在靜止或流動(dòng)的空氣中，通過加熱空氣來保持柱溫。 溫度控制 從實(shí)踐出發(fā)，圖1和2的例子說明為了獲得一致的結(jié)果我們必須要控制柱溫，使用柱溫箱是最好的辦法。最近，施耐德等人發(fā)現(xiàn)能夠?qū)囟茸鳛橐粋€(gè)調(diào)整選擇性的有力工具。而當(dāng)溫度更高時(shí)，峰3將會(huì)移到峰4之后。當(dāng)條件確定以后，這個(gè)規(guī)律就是可預(yù)測的。峰4和5的相對(duì)位置沒有十分明顯的變化，但是，當(dāng)溫度升高時(shí)，峰3會(huì)移近峰4。值得注意的一個(gè)有趣現(xiàn)象是，選擇性的變化是和成分相關(guān)的，例如圖1中當(dāng)溫度變化后最后三個(gè)峰的相對(duì)位置幾乎不變。圖1中，25℃時(shí)第二個(gè)峰和第一個(gè)峰很接近，但當(dāng)溫度升高后，第二個(gè)峰卻遠(yuǎn)離第一個(gè)峰，接近第三個(gè)峰。即便如此，若梯度洗脫時(shí)不控制溫度的話，保留值一般都會(huì)有較大的變化。平均來說，%/℃。圖2是苯胺和苯酸在三個(gè)溫度條件下的色譜圖。這就是我們要使用柱溫箱的原因之一。 還有一個(gè)可能的溫度影響因素就是色譜儀器在實(shí)驗(yàn)室的位置。 擁有溫控系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室一般都有全天候溫控設(shè)置，但這種設(shè)置可能引起室溫顯著變化，這對(duì)整夜運(yùn)行的色譜系統(tǒng)就會(huì)有一些影響，例如我們實(shí)驗(yàn)室的夜間溫度就設(shè)為47℃。圖1顯示了三個(gè)不同溫度下的分離結(jié)果。溫度的影響在所有的色譜分析方式中都是存在的，本文就來討論液相色譜方法中的梯度洗脫方式受溫度影響的問題。如果實(shí)驗(yàn)室的溫度能保持不變的話，不會(huì)有什么大問題。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管，因而壓力太高時(shí)，可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi）。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象，但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。PEEK管路容易連接；PEEK接頭不僅無需工具，手?jǐn)Q即可固定，而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。色譜柱大約需要（以1mL/min的流速）沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被徹底浸潤，恢復(fù)到正常狀態(tài)?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑（如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇）沖洗色譜柱以除去氣體。同樣，整個(gè)色譜柱干涸的情況不
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