【正文】 。 ? 如鱟試劑 λ=, ? 則其內毒素含量為 ? = ,符合規(guī)定。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 100 編號 內毒素濃度 /配 制液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 內濃度度 管數(shù) 結果 A 無 /供試品溶液 檢查水 1 2 ++ 2 2 ++ 4 2 8 2 B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2λ 2 ++ C 2λ/檢查用水 檢查水 1 2λ 2 ++ 2 1λ 2 ++ 4 2 8 2 D 無 /檢查用水 2 江蘇省蘇州藥品檢驗所 101 ? 如為葡萄糖注射液。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 99 ? 系列 溶液 A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以 λ， 為每個系列的 反應終點濃度 ， 所有平行管 反應 終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度 （ 按公式 CE=lg1（ ∑X/2） ） 。 ? D：陰性對照 。 ? B：含 2λ濃度標準內毒素的溶液 A（ 供試品陽性對照 ） 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 96 編號 內毒素濃度 /配 制液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 內濃度度 管數(shù) A 無 /供試品溶液 檢查水 1 2 2 2 4 2 8 2 B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2λ 2 C 2λ/檢查用水 檢查水 1 2λ 2 2 1λ 2 4 2 8 2 D 無 /檢查用水 2 江蘇省蘇州藥品檢驗所 97 ? 注 A：沒有超過 MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液 。依表 3制備溶液 A、 B、 C和 D。 ? 3 、 具 體 操 作 ： 取 鱟 試 劑 18 支（ ， ） ， 各加供試液 ， 放置 5分鐘 ， 以四支為一組 ， 分別依次加入 、 、 和水 ,輕輕混合 ， 置水浴 60分鐘 ， 觀察結果 ， 計算靈敏度 ， 看此靈敏度是否在 ~2λ范圍內 。 ? 例：注射用頭孢拉定的干擾試驗 ? 注射用頭孢拉定 規(guī)格： ， 內毒素限值為 , 所用鱟試劑靈敏度為 0 .25EU/ml ? 供試液的制備：取 1瓶加水 5ml溶解（ 100 mg/ml） ,該溶液的內毒素限值L=20EU/ml， 再稀釋 80倍 （ 最大有效稀釋倍數(shù) ） ， 即為供試液 。 此為藥典方法 。 此為藥典方法 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 88 干擾試驗預試驗 ? 取 1 批 經(jīng) 熱 原 測 定 合 格 的 樣 品（ L=15EU/ml） ， 用 BET水將其作 60、 1 2 480倍稀釋 ，并以此溶液來溶解和稀釋內毒素 ， 使每個稀釋度中內毒素的含量均為 2?，與靈敏度為 應 。 ? 干擾試驗的方法：就是在供試品存在的情況下 ， 測定鱟試劑的靈敏度是否符合規(guī)定 ， 來判斷供試品是否存在干擾的一種方法 。 ? 當鱟試劑 、 供試品的配方 、 生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時 ， 須重新進行干擾試驗 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 81 靈敏度復核值 λ C計算 λ C=lg1(Σ X/4) ? X為反應終點內毒素濃度的對數(shù)值 ? λ C應為標示靈敏度 λ 的 （即 λ 2 λ ),認為該試劑靈敏度符合規(guī)定，但使用時仍以標示靈敏度為準。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 78 江蘇省蘇州藥品檢驗所 79 陰性為 ， 2倍系列全為 +， 倍系列全為 ，復核實驗成功。封口， 37度 60分鐘。 取待復鱟試劑 20支( 靈敏度為 ) ， 各加水；用內毒素工作標準品來復核 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 72 鱟試劑的靈敏度復核設計 編號 內毒素濃度 /配 制液 稀釋用液 稀釋倍數(shù) 內濃度度 管數(shù) 1 2λ/檢查用水 /檢查水 1 2λ 4 2 2 1λ 4 3 4 4 4 8 4 5 無 /檢查用水 2 江蘇省蘇州藥品檢驗所 73 目的 是復核 鱟試劑的靈敏度 是否符合要求 。 凡樣品管兩支均為（ ） ， 則樣品檢查 符合規(guī)定 ；如兩支樣品管中有任何一管出現(xiàn) （ +） ，則樣品檢查 不符合規(guī)定 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 67 江蘇省蘇州藥品檢驗所 68 結果觀察 ? 凡凝膠堅硬 ， 不變形 、 不流動 、不滑脫者為 陽性 （ 記作 +） ；凡無凝膠形成 、 或雖有凝膠但凝膠變形 、 流動 、 滑脫者為 陰性（ 記作 ） 。樣品管 再分別加入樣品 供試液 ， 陰性對照管再加 ， 陽性對照管再加入內毒素液 （濃度為 2 λ 即 ）。 最終內毒素的濃 度 為 鱟 試 劑 靈 敏 度 λ 的 兩 倍 ，( 2=） 。 ? 取一支內毒素 ， 用砂輪片割開安瓿曲頸上端 ， （ 盡量保留較長的安瓿頸 ） ， 加入 1ml無熱原水 （ 以下簡稱水 ） ， 用膠布在灑精燈上燒灼后封口 。供試液制備：在 無菌條件下 進行 . ? 液體類 ：取供試品直接稀釋：根據(jù)供 試 品 的 內 毒 素 限 值 （ 如L=)和所用鱟試劑的靈敏度 λ （ 如 λ =)進行 ， 稀釋倍數(shù) =L/λ =2 江蘇省蘇州藥品檢驗所 63 ? 粉末類 ：原料和注射用粉針 ? 根據(jù)供試品的內毒素限值 （ 如L=)和所用鱟試劑的靈敏度λ （ 如 λ =)進行 。 ? 細菌內毒素工作標準品 ： 10500EU/支 ，中國藥品行物制品檢定所生產 。 ? 如：注射用頭孢拉定L=， 注射用頭孢曲松鈉 L= 江蘇省蘇州藥品檢驗所 61 1． 實驗器材和準備工作 ? 鱟試劑 （ 注意選擇規(guī)格和靈敏度 λ ） ：例：選用裝量為 ， 靈敏度 λ 為 。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 60 ? 藥品的細菌內毒素限值 ： 一般標準上已經(jīng)給出 。 C因子 活化的 C因子 內毒素 活化的 B因子 B因子 凝固酶 凝固酶原 凝固蛋白 （ 凝膠 ） 凝固蛋白原 β (1,3)D葡聚糖或 LALRM 活化的 G因子 （旁路反應） G因子 二價陽離子 凝膠法鱟試劑與內毒素的反應機理 ——復雜的酶促反應過程 凝膠限量法實驗設計 編號 內毒素濃度 /配制內毒素的溶液 平行管數(shù) A 無 /供試品溶液 2 B 2λ/供試品溶液 2 C 2λ/檢查用水 2 D 無 /檢查用水 2 凝膠限量試驗設計 2022版藥典 溶液 平行管數(shù) ? NPC 2 ? NC 1 ? PC 1 ? PPC 1 ? 試驗有效性： NC為陰性，PC和 PPC均為陽性。 ? 自身凝集 ? 緩沖能力 ? 干燥失重 ? 無菌 江蘇省蘇州藥品檢驗所 56 細菌內毒素檢查用水 ? 凝膠法 細菌內毒素檢查用水系指內毒素含量小于 滅菌注射用水 。 鱟 — 四億年前就存在的古老的海洋生物 江蘇省蘇州藥品檢驗所 50 這就是鱟 江蘇省蘇州藥品檢驗所 51 江蘇省蘇州藥品檢驗所 52 江蘇省蘇州藥品檢驗所 53 鱟試劑：鱟血液變形細胞裂解物冷凍干燥制備而成 鱟試劑的種類：依據(jù)鱟的種類分： 美洲鱟試劑（ LAL） 中國鱟試劑（ TAL） 圓尾鱟試劑（ CAL） 依據(jù)檢查方法分： 凝膠法鱟試劑和定量法鱟試劑 江蘇省蘇州藥品檢驗所 54 江蘇省蘇州藥品檢驗所 55 ? 鱟試劑的主要質量指標 ? 靈敏度：表示在細菌內毒素檢查法規(guī)定的條件下，能檢測出標準內毒素水溶液中最低內毒素濃度。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 48 江蘇省蘇州藥品檢驗所 49 鱟試劑 ? 認識：一種海洋無脊椎動物，藍色的血液。 國際標準品 （ IS） 參考標準品 （ RSE） 國家標準品 （ NS） 標準內毒素 工作標準品 （ CSE） 江蘇省蘇州藥品檢驗所 45 2)環(huán)境內毒素（ EET） 天然產生的內毒素，普遍存在于水、空氣和各種原料中，成分除了脂多糖外還含有較多的蛋白質、多糖和其它雜質。 ? 熱原與內毒素的關系在學術上仍有爭論，但 在GMP的條件下，在藥檢的范疇里，內毒素是主要的熱原物質，可以說無內毒素就無熱原，控制內毒素就控制熱原 。關于熱原的定義在學術上還有爭論。 順應全球國際醫(yī)藥貿易一體化的需要，從 2022年 1月起，美國藥典（ USP），歐洲藥典（ EP）以及日本藥局方（ JP）開始執(zhí)行統(tǒng)一的 BET法，即 “ BET國際協(xié)調方案 ” 。 BET取代 PT是已成為必然的趨勢。 CP2022年版有 112種藥品規(guī)定作 BET項。 江蘇省蘇州藥品檢驗所 37 BET技術的應用與發(fā)展的趨勢與特點 BET取代 PT成為必然的趨勢 ? 1980年的 USPXX版收載 BET法，但未規(guī)定任何