cr的種類及應(yīng)用ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-01-14 00:23本頁(yè)面
【正文】 步驟 同一般的 PCR操作相同，只是反應(yīng)中所加入的是多對(duì)引物而不是一對(duì)引物。而后，反應(yīng)混合物中的另一種高濃度的引物，則利用限制引物合成的 DNA鏈做模板，繼續(xù)引導(dǎo) DNA合成。 不對(duì)稱 PCR 2022/2/3 14 基本原理： PCR擴(kuò)增所用的兩條引物中，濃度受限制的只及高濃度的 1%（或 2%）。 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一種專門(mén)用于制備單鏈 DNA的技術(shù) — 不對(duì)稱 PCR技術(shù)。 2022/2/3 13 就像任何 DNA一樣， PCR的雙鏈 DNA產(chǎn)物也可以供序列測(cè)定使用。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶 DNA。 應(yīng)用于染色體步移、轉(zhuǎn)位因子和已知序列 DNA旁側(cè)病毒整合位點(diǎn)分析等研究。倒數(shù)第二個(gè)最好是 G/C PCR的各種變體 ? 反向 PCR (Inverse PCR, IPCR) ? 不對(duì)稱 PCR (asymmetric PCR) ? 多重 PCR ? 熒光定量 PCR（ QPCR) ? 反轉(zhuǎn)錄 PCR (reverse transcription,RT PCR) ? 巢式 PCR (NEST PCR) ? 遞減 PCR(Touchdown PCR) 2022/2/3 10 ? 原理： 擴(kuò)增引物相反方向 DNA 序列的技術(shù) 。 ? 內(nèi)部的具有自身互補(bǔ)性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)不超過(guò) 4個(gè)，其二聚體中不超過(guò) 8個(gè)。 引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)引物可以采取以下原則： ? GC所占比例為 40％－ 60％ ? 兩個(gè)引物的 Tm， 相差小于 5℃ ，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm與引物的相差不超過(guò) 10℃ 。 循環(huán)中的變性步驟 循環(huán)中一般 95℃ ， 30秒足以使各種靶 DNA序列完全變性： 變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。 引物延伸 引物延伸一般在 72℃ 進(jìn)行（ Taq酶最適溫度）。 引物退火（ Primer annealing） 退火溫度一般需要憑實(shí)驗(yàn)（經(jīng)驗(yàn)）決定。 它可以在試管里建立反應(yīng)，經(jīng)過(guò)數(shù)小時(shí)之后，就能將極微量的目的基因或者某一特定的 DNA片段擴(kuò)增數(shù)十萬(wàn)倍，乃至千百萬(wàn)倍，而無(wú)需通過(guò)繁瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序，便可獲得足夠數(shù)量的精確的 DNA拷貝，所以有人亦稱為無(wú)細(xì)胞的分子克隆法。這個(gè)酶只有 5′→3′DNA 聚合酶活性和 5′→3′ 的外切酶活性，缺少 3′→5′ 的外切酶活性。 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌 (Thermusaquaticus)yT1株分離提取的 .yT是 一種嗜熱真菌，能在 7075℃ 生長(zhǎng) .存在于水生嗜熱菌 (Thermus aquaticus)的嗜熱 DNA聚合酶，可在 74℃ 復(fù)制 DNA，在95℃ 仍具有酶活力。 ③ 5’→3 ’外切酶活性：切除受損傷的 DNA，可用于切口平移（ nick translation). 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ 的 Klenow片段是完整的 DNA聚合酶 Ⅰ 的一個(gè)片段，只有在 5’→3 聚合酶活性和 3’→5 ’外切酶活性，失去了 5’→3 外切酶活性。 2022/2/3 5 ① 5’→3 ’的聚合作用：不是復(fù)制染色體而是修補(bǔ) DNA，填補(bǔ) DNA上的空隙或是切除 RNA引物后留下的空隙。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，故稱復(fù)制叉。穆利斯的想法是，利用一種人工方法，和反復(fù)相同程序的方法，
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