【正文】 en specific T cell response IFNγ release was much stronger in protein Tat+T group than in the other This preliminary result showed that immunization with those improved rebinant polyepitope antigen has high antigenicity, especially in induction of high CTL response. This research may be useful to further development of immunotherapy for HCC. 【 Key words】 hepatocellular carcinoma。結(jié)果 正確構(gòu)建復(fù)合表位基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，目的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中獲到高效表達(dá)，并得到有效純化； ELISPOT 檢測(cè)顯示 Tat+T 蛋白免疫組能更有效地激發(fā)特異性 T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。 收藏 分享 評(píng)分 【摘要】 目的 構(gòu)建肝癌多表位基因和含 Tat PTD 的多表位基因的原核表達(dá)載體，表達(dá)純化融合蛋白，比較其細(xì)胞免疫反應(yīng)。此方法可測(cè)定細(xì)胞受到刺激后，產(chǎn)生細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量，及未接受和 /或接受治療的病人中細(xì)胞因子生成細(xì)胞的量?，F(xiàn)介紹 檢測(cè)人 IFNγ 為例的PVDF Elispot 法，僅供參考。英國(guó)牛津大學(xué) Nuffield 臨床醫(yī)學(xué)系 Lalvani 及其同事報(bào)告：這些抗原不存在于牛 結(jié)核分支桿 菌 BCG 和大多數(shù)環(huán)境中的分枝桿菌。本文介紹了 ELISPOT 法的原理 ,方法和應(yīng)用領(lǐng)域等知識(shí) . ELISPOT 診斷結(jié)核病更快速更準(zhǔn)確 文 件 大小 KB (19,968 字節(jié) ) 文件類型 DOC 文檔 英國(guó)的研究人員最近報(bào)道了一種比結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（ TST）更為有效的快速血液試驗(yàn)方法。 80年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分 泌細(xì)胞的 固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT）。IC/Flow Cytometry 的比較 文件大小 KB (24,576 字節(jié) ) 文件類型 DOC 文檔 隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 ,使體外檢測(cè)各種細(xì)胞 因子及抗體研究有了新的突破。 [ 本帖最后由 自主創(chuàng)新 于 2022315 22:25 編輯 ] Elispot 知識(shí) Elispot 與 51Cr Release。 反應(yīng)步驟可大致分為： （ 1） 利用特定細(xì)胞因子的單克隆抗體包被 96 孔板，封閉剩余的空白位點(diǎn)； （ 2） 加入細(xì)胞懸液，用特異性抗原刺激、活化細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞因子，細(xì)胞因子會(huì)往附近擴(kuò)散與之前包被的抗體進(jìn)行特異結(jié)合； （ 3） 洗掉細(xì)胞； （ 4） 加入酶標(biāo)二抗特異與細(xì)胞因子進(jìn)行結(jié)合，通過(guò)底物的顯色反應(yīng)，一個(gè)細(xì)胞所在位置就會(huì)顯出斑點(diǎn)，最后利用顯微鏡或者特定的讀板機(jī)（ reader）就可以計(jì)算出樣品中被激活細(xì)胞的數(shù)目。一般而言，記憶型 T 細(xì)胞在受抗原刺激數(shù)小時(shí)后會(huì)開始分泌細(xì)胞激素，此時(shí)局部 (在緊靠分泌細(xì)胞的周圍 )分泌出的細(xì)胞激素會(huì)被 PVDF 薄膜上特異抗體捕獲。其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是在 96 微孔培養(yǎng)盤底部披覆 PVDF 薄膜，用來(lái)吸附特殊挑選、且無(wú)毒性（不含 sodium azide、內(nèi)毒素 endotoxin）的單株抗體。 傳統(tǒng)的 ELISA 與 ELISPOT 都是根據(jù)酶免疫學(xué)檢測(cè)原理，通過(guò)酶的高催化頻率，放大反應(yīng)效果，從而達(dá)到很高敏感度的檢測(cè)效果。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。 原理 ELISPOT 就其原理來(lái)說(shuō)實(shí)在是很簡(jiǎn)單的，從本質(zhì)上說(shuō)和 ELISA 的原理是一樣的，理解起來(lái)并不難。 2022 年 1 月，世界衛(wèi)生組織通過(guò)與大陸北京性艾中心合作，將應(yīng)用 ELISPOT 技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè) HIV 疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù)，該計(jì)劃將是首次利用ELISPOT 技術(shù)對(duì)亞洲國(guó)家從事 HIV 疫苗研究和臨床試驗(yàn)的有關(guān)研究。 從各國(guó)文獻(xiàn)可見 ELISPOT 技術(shù)已經(jīng)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的要求，并被廣泛地應(yīng)用在多項(xiàng)領(lǐng)域，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時(shí)的反應(yīng) (Lewis, 2022 and Jazki, 2022)，以及感染性疾病 (Moss, 2022, Rahman, 2022, RowlandJones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2022)、腫瘤 (Nagorsen, 2022)、或自體免疫病人體內(nèi)的一個(gè)特定的免疫反應(yīng)型式 (Pelfrey, 2022)。同理，一個(gè)血樣或標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品可被分裝小份，被送到不同檢驗(yàn)中心進(jìn)行測(cè)試，以交互比對(duì)，同時(shí)有利 LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。此外由于 ELISPOT Cytokine 技術(shù)被證實(shí)適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后 PMBC 與新鮮分離樣品有相當(dāng)?shù)男r(jià)，沒(méi)有喪失功能。此技術(shù)是當(dāng)世唯一準(zhǔn)許百萬(wàn)分之一 1:1000,000 的準(zhǔn)確分析，如此強(qiáng)效的解析力使流式細(xì)胞技術(shù)也望其項(xiàng)背，以目前國(guó)內(nèi)外常規(guī)的 intracellular cytokine 或者 Dimer/ tetramer 染色，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。藥物抑制 T 細(xì)胞免疫一般可通過(guò)兩程截然不同的機(jī)轉(zhuǎn)；使能分泌 Cytokine 的 Precursor T 細(xì)胞族群變小，或減少每 Precursor T細(xì)胞的 cytokine 產(chǎn)能，而 ELISPOT 技術(shù)能提供雙份信息。在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下， ELISPOT Cytokine 斑點(diǎn)的數(shù)量分析顯示斑點(diǎn)是由一個(gè)單細(xì)胞所生成，同時(shí)斑點(diǎn)形態(tài)學(xué)與 Time Response 分析則顯示斑點(diǎn)直徑大小直接反映該細(xì)胞族群的產(chǎn)能。 多年來(lái)經(jīng)過(guò)數(shù)十個(gè)研究團(tuán)隊(duì)的致力研究，對(duì)于 ELISPOT 分析技術(shù)本身的幾個(gè)問(wèn)題，也有了科學(xué)上的驗(yàn)證。沒(méi)有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問(wèn)題，諸如； 實(shí)驗(yàn) 所得的斑點(diǎn)是抗原特定 T 細(xì)胞所生產(chǎn)，還是旁觀細(xì)胞受 Cytokine 刺激的次級(jí)效應(yīng)？ 斑點(diǎn)的小或大有何生理意義；如何決定 cutoff 值？ 能否相信斑點(diǎn)是由單一的細(xì)胞造成？ ELISPOT Cytokine 分析技術(shù)能準(zhǔn)確測(cè)量的頻率范圍？ 如果效應(yīng)相互拮抗的 cytokine 同時(shí)產(chǎn)生，它們是否會(huì)互相妨礙？及到什么程度？ （ 2） ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在 1996 年以來(lái)隨著抗體制備、 PVDF 膜材篁等技術(shù)改良， ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它已是當(dāng)世公認(rèn)最 靈敏抗原特定 T 細(xì)胞的體外檢測(cè)技術(shù)。同樣的人體 PBMC 樣品，在通過(guò)完全相同的實(shí)驗(yàn)， Panel A 呈現(xiàn)較清晰的小色點(diǎn)。與原來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDF 薄膜提供 1,000 倍的較大面積來(lái)吸附單株抗體，使 T 細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞因 子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點(diǎn)集中、清晰、對(duì)比色高，大大的提高 ELISPOT Cytokine 分析的敏感度。早期 ELISPOT 的分析條件不是非常理想，成對(duì)抗體的品質(zhì)、呈色底膜的材質(zhì)等幾個(gè)技術(shù)性的問(wèn)題，使當(dāng)時(shí)多數(shù)研究團(tuán)隊(duì)很難獲得清晰的斑點(diǎn)，結(jié)果是敏感度不夠、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低。 ELISPOT Cytokine 技術(shù)雖說(shuō)操作簡(jiǎn)單，但該技術(shù)并沒(méi)能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在 ex vivo T 細(xì)胞功能研究。 Czerkinsky 等人率先在 1983 年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測(cè)出因受激而分泌抗體的 B 細(xì)胞頻率。 下面將從發(fā)展、原理、具體實(shí)驗(yàn)操作、技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用幾方面進(jìn)行介紹。（某些研究不僅要測(cè)細(xì)胞因子生成量，還需檢測(cè)分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率） 由于是單細(xì)胞水平檢測(cè)， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬(wàn) 30 萬(wàn)細(xì)胞中檢出 1 個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。兩者都是檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白，它們最大的不同在于： （ 1） ELISA 通過(guò)顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。由于該方法具有較高的特異性和敏感性，易操作，成本相對(duì)流式細(xì)胞分析術(shù)也較低，已被廣泛用于分泌 CK 細(xì)胞檢測(cè)或 ASC 測(cè)定中，對(duì)探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 80 年代，國(guó)外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測(cè)特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ ELISPOT ）。 ELISPOT 技術(shù)原理 在免疫學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)于疾病以及疫苗研究不僅僅局限于體液免疫應(yīng)答（ B 細(xì)胞免疫），細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答 (cell mediated immune response， CMI)也是人 們所關(guān)注的，而 T 細(xì)胞在 CMI 中起關(guān)鍵作用。事實(shí)上到目前為止，以目視法判讀少量細(xì)胞族群的特性如激活 T 細(xì)胞之激素分泌，仍被視為是免疫學(xué)技術(shù)上的一大挑戰(zhàn)。計(jì)算機(jī)可以利用斑點(diǎn)的深淺、是否以中心為原點(diǎn)向四周減淡等特征對(duì)細(xì)胞分泌動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，這項(xiàng)技術(shù)的成熟相信會(huì)使ELISP