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westernblot實(shí)驗(yàn)步驟-文庫(kù)吧資料

2025-05-19 00:52本頁(yè)面
  

【正文】 樣品兩側(cè)的泳道用等體積的 1 loading buffer上樣 , Marker也用 1 loading buffer調(diào)整至與樣品等體積 , 這樣可以避免最邊上的孔道電泳時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)散 ,使最邊上的孔道電泳出現(xiàn)誤差 。試劑的終濃度為 %考馬斯亮藍(lán) G250, %(W/V)乙醇,和 %(W/V)磷酸。反應(yīng)化合物在 595nm處有最大光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系。 4度, 12021轉(zhuǎn),離心 15分鐘,收集上清 . ? 組織樣品 :液氮研磨組織,按每 20毫克組織加 100200微升的比例加入 RIPA,冰上裂解 30分鐘, 4度, 12021轉(zhuǎn),離心 30分鐘,收集上清 . 蛋白樣品的制備 輝駿生物: 免費(fèi)服務(wù)熱線: 4006991663 蛋白樣品的定量 Bradford法測(cè)定蛋白濃度 ? 原理: 此法基于考馬斯亮藍(lán) G250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。按 6孔板 100200微升 /孔的比例加入 PIPA(可根據(jù)細(xì)胞多少調(diào)節(jié)裂解液體積) , 4度, 12021轉(zhuǎn),離心 15分鐘,收集上清 . ? 懸浮細(xì)胞 : 收集培養(yǎng)細(xì)胞,離心去除培養(yǎng)液,用 PBS洗 23遍,按 6孔板加入 100200微升 /孔的比例加入 RIPA,用搶懸浮細(xì)胞。 圖片分析: 標(biāo)定 Marker,進(jìn)行分析與掃描 。置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中,迅速蓋上膠片,關(guān)閉膠盒,根據(jù)所見熒光強(qiáng)度曝光。 二抗孵育: 5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度,與膜室溫孵育 1小時(shí), 1x TBST,洗膜 3次,每次 5分鐘。 封閉: 5%脫脂奶粉或 BSA封閉過夜或室溫 1小時(shí)。 電泳: 依據(jù)需要檢測(cè)蛋白的分子量選取膠的濃度,制膠,電泳。 輝駿生物: 免費(fèi)服務(wù)熱線: 4006991663 Western Blot 信號(hào)放大基本原理 經(jīng)過 SDSPAGE分離的蛋白質(zhì)、多肽等被轉(zhuǎn)移到固相支持膜上,然后用蛋白質(zhì)或多肽特異性的抗體來檢測(cè) 一級(jí)信號(hào)放大 二級(jí)信號(hào)放大 一抗 抗原 抗原 一抗 二抗
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