【正文】 應(yīng)為方法的 LOQ(非 LOD) —— 回歸方程的截距應(yīng)接近于零 —— 相關(guān)系數(shù)要求 ?≥(色譜法 )或 ≥(生物學(xué)方法 ) —— 若非線性 ， 可分為高低 兩個(gè)濃度區(qū)間 (每個(gè)區(qū)間不少于 5個(gè)濃度 )， 分別加權(quán)回歸 —— 如 20和 50、 100、 200 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 42 三、準(zhǔn)確度 方法準(zhǔn)確度 (accuracy) —— 系指用該方法 測(cè)得的生物樣品中待測(cè)藥物的濃度與其真實(shí)濃度的接近程度 —— 應(yīng)使用實(shí)際生物樣品測(cè)定 ， 但實(shí)際生物樣品的濃度是未知的所以 ， 通常使用模擬生物樣品測(cè)定 —— 一般用 相對(duì)回收率 (relative recovery， RR) 或 相對(duì)誤差(relative error， RE)表示 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 43 1. 測(cè)定法 取空白生物基質(zhì) （ 如血漿 ） 數(shù)份 ， 照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作 ，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控 (quality control， QC)樣品 —— 高 (接近上限 )、 中 、 低 (接近 LOQ) 3個(gè)濃度 —— 每一濃度至少 5個(gè)樣本 —— 與隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線同法測(cè)定 、 計(jì)算 ， 每個(gè)樣品分析測(cè)定 1次 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 44 2. 結(jié)果計(jì)算與限度要求 計(jì)算 —— 測(cè)定值 M (measured)平均值與理論濃度 (加入值 )A(added)比值 相對(duì)回收率 相對(duì)誤差 限度要求 —— 相對(duì)回收率應(yīng)在 85%～ 115% (LOQ附近 80%～ 120%) —— RE在 177。( iii yyw ? ???????? ? 239。( iii yyw? ? 2)39。 39。 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo) (Y) 用最小二乘法計(jì)算回歸方程 Y＝ a＋ bX (坐標(biāo)標(biāo)度相等 ) 相關(guān)系數(shù) (r)——表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 —— 若 r ≠1， 表示擬定方法為非線性 ， 如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 31 4. 與參比方法的相關(guān)性 Y＝ a＋ bX 截距 (a) —— 表示擬定方法受到 恒定干擾 的程度 —— 內(nèi)源性物質(zhì) (UV) 斜率 (b) —— 表示擬定方法受到 比例干擾 的程度 —— 標(biāo)記抗原不純 (RIA) 與參比方法的相關(guān)性比較 —— 除顯示分析方法的特異性外 —— 斜率 b表示兩種方法測(cè)得結(jié)果的一致性 若參比方法準(zhǔn)確度良好 —— 若截距 a≈0, 則擬定方法的準(zhǔn)確度 (回收率 )為 100b(%) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 32 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線 （ standard curve） —— calibration curve or working curve —— 生物樣品中所測(cè)定藥物濃度與響應(yīng)的 相關(guān)性 （ 比例的程度 ） —— 通常用回歸分析方法所得的 回歸方程 來評(píng)價(jià) —— 除少數(shù)方法 （ 免疫分析法 ） 外 ， 標(biāo)準(zhǔn)曲線通常為 線性模式 —— 回歸分析法為 最小二乘法 （ least squares） 或 加權(quán)最小二乘法 （ weighted least squares） 線性范圍 （ linear rang） —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高與最低濃度的區(qū)間 —— 模擬生物樣品的測(cè)定結(jié)果應(yīng)達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度和準(zhǔn)確度 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 33 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 (續(xù) ) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 —— 用 模擬生物樣品 建立 —— 線性范圍 (不包括零點(diǎn) )應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度 —— 不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線所使用的模擬生物樣品 —— 應(yīng)使用與待測(cè)的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 34 標(biāo)準(zhǔn)曲線的一般建立方法 1. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 (非生物基質(zhì)溶液 )的制備 溶劑 —— 水或甲醇 （ 或其他適當(dāng)溶劑 ） 濃度 —— 標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品中藥物濃度的 50倍以上 加入量為生物樣品總體積的 2%以下 避免標(biāo)準(zhǔn)模擬生物樣品與實(shí)際樣品存在較大差異 濃度較低 —— 應(yīng) 除去溶劑 后再加入生物基質(zhì) 否則 ,在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 35 2. 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度范圍 至少含 5～ 8個(gè)濃度點(diǎn) (不包括零點(diǎn) ,即空白 ) —— 可 覆蓋全部待測(cè)生物樣品中的藥物濃度 如： 50、 100(等比梯度模式 — 比例常數(shù)約為 2) 若體內(nèi)平均達(dá)峰濃度為 50， 其 1/20為 設(shè)定最高濃度為 100， 最低濃度為 1 (個(gè)體差異 ) 實(shí)際制備時(shí)： 500、 250、 100、 50、 10 …… 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 36 3. 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì) (如血漿 )—— 加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液適量 ， 渦旋混勻 為防止在標(biāo)準(zhǔn)溶液加入及渦旋混合時(shí)造成的損失 —— ① 先加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 ③ ② 再加入空白生物基質(zhì) ③ 渦旋混勻 ① ② 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 37 4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以待測(cè)藥物的檢測(cè)響應(yīng) (如色譜峰面積或峰高 ) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)的比值 (內(nèi)標(biāo)法 )(因變量 , y )對(duì)模擬血藥濃度 (自變量 ,x) —— 求得回歸方程 ( y＝ a＋ bx )及其相關(guān)系數(shù) ( ? ) 在一組由至少 7個(gè)濃度 (不包括零點(diǎn) )構(gòu)成的標(biāo)準(zhǔn)曲線中 ， 至多可有 2個(gè)濃度點(diǎn)數(shù)據(jù) ， 可予剔除 。2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 1 第四章 體內(nèi)藥物分析 方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 2 ?分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) ?分析方法建立的一般步驟 ?分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 ?體內(nèi)藥物分析應(yīng)用示例 本章內(nèi)容提要 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 3 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 建立分析檢測(cè)方法的主要依據(jù) ? 待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況 ? 分析測(cè)定的目的與要求 ? 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 ? 實(shí)驗(yàn)室條件 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 4 一、 待測(cè)藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況 準(zhǔn)確測(cè)定生物樣品中的藥物或其特定代謝物 —— 預(yù)處理 —— 待測(cè)物 從結(jié)合物或綴合物中 釋放 選擇樣品預(yù)處理方法 —— 首先應(yīng)考慮 —— 待測(cè)藥物的 理化性質(zhì) —— 藥物在生物體內(nèi)的 存在狀況 —— 藥物在生物體內(nèi)的 生物轉(zhuǎn)化 (代謝 )途徑 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 5 (一 )待測(cè)藥物的理化性質(zhì) 藥物的 pKa值 、 親脂性 、 溶解度 、 分配系數(shù)等 —— 預(yù)處理及檢測(cè)方法 具有親脂性 —— 在適當(dāng)?shù)?pH值下用 溶劑萃取 具有強(qiáng)極性或親水性 —— 沉淀蛋白 、 固相萃取 、 離子對(duì)萃取或衍生化后萃取 等 具有揮發(fā)性 —— GC測(cè)定法 具有光譜或電化學(xué)特性 —— 分析檢測(cè)方法 藥物的穩(wěn)定性 —— 萃取濃縮技術(shù) 對(duì)酸堿不穩(wěn)定 —— 避免使用強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性溶劑 對(duì)熱不穩(wěn)定 —— 避免高溫蒸發(fā)溶劑 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 6 (二 )待測(cè)藥物的體內(nèi)存在狀態(tài) ?與血漿蛋白結(jié)合的強(qiáng)弱及結(jié)合率的高低 —— 分離萃取方法 ?蛋白結(jié)合較強(qiáng) —— 不宜直接采用溶劑萃取 ?體內(nèi)濃度高低 、 代謝過程及其代謝產(chǎn)物 —— 分析檢測(cè)技術(shù) ?濃度較低 （ 尤其有代謝產(chǎn)物共存 ） —— 代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時(shí)測(cè)定 —— 采用 LCMS、 EIA等分析檢測(cè)技術(shù) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 7 二、分析測(cè)定的目的與要求 體內(nèi)藥物分析的目的 —— 影響分析方法的應(yīng)用 ?藥代動(dòng)力學(xué) —— 研究藥物在體內(nèi)吸收 、 分布 、 代謝和排泄過程 —— 血漿濃度隨時(shí)間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物 要求 —— 同時(shí)測(cè)定原形藥物和代謝產(chǎn)物 檢測(cè) —— 寬線性范圍 (Cmax～ Cmax的 1/20)、 高靈敏度 (109g/ml)和高專屬 性 (分離能力 )(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離 ) 方法 —— 不必強(qiáng)調(diào)方法的簡(jiǎn)便